Raltitrexed以浓度依赖的方式引起双链DNA断裂，在包含野生型p53的Lovo细胞和LS174T细胞系中，Raltitrexed使Bax蛋白水平最多增加5倍。在人类结肠癌细胞中，Raltitrexed被积极吸收进入细胞内，然后迅速而广泛地代谢成一系列的聚谷氨酸酯，有效抑制胸苷酸合成酶。Raltitrexed可迅速到达大脑，并在5分钟内被检测到所有大脑组织中。在人类结肠癌细胞中，Raltitrexed与SN-38的联合应用在一定浓度范围内产生协同的细胞毒性效应。Raltitrexed是一种特异性基于叶酸的胸苷酸合成酶抑制剂。对高级直肠癌活性的影响与氟尿嘧啶(5-fluorouracil)加亚叶酸钙的效果相似。Raltitrexed通过快速细胞内进入和谷氨酰化作用发挥活性，其谷氨酰化衍生物的活性是原始化合物的100倍以上。在HCT-8细胞系中，Raltitrexed导致细胞内磷酸核糖焦磷酸(PRPP)增加，表明Raltitrexed与5-FU结合的细胞毒作用是由于5-FU的核苷酸形成增加。Raltitrexed与亚叶酸钙(5FU-FA)的联合显示了一种依赖于模式的协同抑制增殖作用，通过测量联合系列来确定。Raltitrexed与Vorinostat联合产生了显著的协同效应，导致细胞周期扰乱和S期阻滞。