H2DCFDA (DCFH-DA) belongs to the class of green fluorescent dyes and is a probe for the detection of intracellular reactive oxygen species (ROS) (Ex/Em=488/525 nm) with cell membrane permeability.

方法：Flow cytometry 检测 ROS 水平：
1、将 H2DCFDA 溶解为 10 mM 的 DMSO 原液，并在使用前用 PBS 进一步稀释。
2、将粘附细胞与 5 µM H2DCFDA 溶液在 37℃ 下避光孵育 30 min，然后用 0.05% trypsin-EDTA 溶液收获，悬浮在新鲜培养基中，并立即用流式细胞仪 (488 nm) 进行分析。[1]
方法：Confocal microscopy 检测 ROS 水平：
1、将 H2DCFDA 溶解为 10 mM 的 DMSO 原液，并在使用前用 PBS 进一步稀释。
2、将含有细胞的盖玻片置于 5 µM H2DCFDA 染色溶液中，在 37℃ 下避光孵育 60 min，然后清洗并用配备有氩激光器的共焦激光扫描显微镜 Leica TCS SL 成像。[1]

方法：fluorescence microscope 分析 LPS 诱导腹膜炎小鼠的氧化活性：
1、将 H2DCFDA 溶解在 100 µL 乙醇中，并在使用前用 PBS 进一步稀释。
2、C57BL/6J 小鼠腹腔注射 LPS (0.1-1mg/mL) 诱导腹膜炎。3.5 h 后，腹腔注射 H2DCFDA (0.1-0.8 mg/ml)。
3、H2DCFDA 注射后 30 min，颈椎脱臼处死动物，用 pH 7.4 的 5 mL 冰冷 HBSS 溶液冲洗，回收腹膜细胞。
4、腹膜细胞用 PBS 洗涤并重悬。在 37℃ 聚苯乙烯培养皿中孵育 30 min，用粘附法除去巨噬细胞。回收上清液，用细胞离心器将大约 20000-25000 个白细胞加到显微镜载玻片上。然后使用荧光显微镜对载玻片进行分析。[2]

使用方法：
一、溶液配制
1. 制备储存液：用 DMSO 配制 10 mM 的 H2DCFDA 储备液。
注：H2DCFDA 储存液建议分装后于 -20 ℃ 或 -80 ℃ 避光保存。
2.工作液的配制：用预热好的无血清细胞培养基或 PBS 稀释储存液，配制成 1-10 μM 的 H2DCFDA工作液。
注：请根据实际情况调整 H2DCFDA 工作液浓度，且现用现配。
二、 细胞染色（悬浮细胞）
1. 离心收集细胞，加入 PBS 洗涤两次，每次 5 分钟。细胞密度在 1×10^6/mL。
2. 加入 1 mL 染料 工作液，室温孵育 5-30 分钟。
3. 400 g，离心 3-4 分钟，弃去上清。
4.加入 PBS 洗涤细胞两次，每次 5 分钟。
5.用 1 mL 无血清培养基或 PBS 重悬细胞后，使用荧光显微镜或流式细胞仪进行观察。
三、细胞染色（贴壁细胞）
1. 将贴壁细胞培养于无菌盖玻片上。
2. 从培养基中移出盖玻片，吸除多余培养基。
3. 加入 100 μL 染料工作液，轻轻晃动使其完全覆盖细胞，孵育 5-30 分钟。
4. 吸去染料工作液，用培养基洗 2-3 次，每次 5 分钟 ，使用荧光显微镜或流式细胞仪进行 观察。
注：若需要用流式细胞仪检测，需将细胞用胰蛋白酶消化重悬后再进行染色。