一、检测活性氧 (Reactive Oxygen Species, ROS)

1. 材料准备
   1）DCFH-DA 探针溶液： 配制 DCFH-DA 储备液（1–10 mM），溶解于无水 DMSO 中，避光保存。
   2）细胞样品： 待测的活细胞或组织样本。
   3）PBS 缓冲液： 用于洗涤细胞，pH 7.4。
2. 实验步骤
   1） 细胞处理： 收集待测细胞，用 PBS 清洗 2-3 次，去除培养基中的干扰物。
   2） 染色： 将 DCFH-DA 稀释至0.1–20 µM，加入细胞培养液中，37°C 孵育 30 分钟，避光处理。
   3） 清洗： 孵育后，用 PBS 缓冲液洗涤细胞，去除未进入细胞的 DCFH-DA。
   4）检测荧光： 使用荧光显微镜或流式细胞仪检测荧光信号。
   激发波长： 488 nm
   发射波长： 525 nm
   二、检测一氧化氮 (Nitric Oxide, NO)
   DCFH-DA 通过间接机制检测 NO 的存在，具体取决于 NO 生成的次级产物（如过氧亚硝酸盐）。
   实验步骤与 ROS 检测类似，适用于 NO 含量变化的间接评估。
   三、总氧化应激评估
   1）将荧光信号与标准曲线对比，定量测定 ROS 或 NO 的水平。
   2）使用空白组（未处理 DCFH-DA 的细胞）和阳性对照（如 H2O2 或 NO 捐赠剂处理组）验证实验结果的可靠性。