4-Methylumbelliferyl phosphate (4-MUP) (4-MUP) is used as a fluorogenic substrate of alkaline phosphatases.

4-Methylumbelliferyl phosphate 与当前可用底物相比有明显优势，其有效浓度范围扩展到约0.1 μM。如果保持 4-Methylumbelliferyl phosphate 的浓度不变，而改变pH值，酶的活性会经历一个最大值。

一、碱性磷酸酶活性检测
1. 4-MUP溶液制备：将4-MUP溶解在适当的缓冲液中，如Tris-HCl（pH 8.0），浓度一般在0.1-1 mM之间。
2. 加入样品：将含有碱性磷酸酶的样品（如血清或细胞裂解液）加入到4-MUP溶液中。根据所需的灵敏度调整最终反应体积。
3. 反应孵育：将反应体系孵育于37°C，通常时间为30分钟到1小时，使酶将4-MUP去磷酸化。
4. 荧光测量：孵育后，通过荧光分光光度计或酶标仪测量4-甲基伞形酮的荧光，激发波长为360 nm，发射波长为450 nm。
5. 数据分析：荧光强度与碱性磷酸酶的活性成正比。通过与标准曲线对比，可以定量样品中的酶活性。
二、 酶联免疫吸附测定（ELISA）中的应用
1. 涂板：在微孔板上涂上感兴趣的抗原或抗体。
2. 加入碱性磷酸酶标记抗体：加入与碱性磷酸酶连接的抗体或酶标记探针。
3. 加入底物：洗涤后加入4-MUP底物。
4. 荧光检测：孵育后，使用酶标仪或荧光板读取器测量荧光信号，激发波长为360 nm，发射波长为450 nm。
5. 结果解读：根据荧光强度定量抗原或抗体的含量。
三、 细胞培养中的碱性磷酸酶检测
1. 细胞处理：在适当的培养基中培养细胞，并根据需要进行处理。
2. 加入4-MUP：将4-MUP溶液加入到细胞培养液中。
3. 荧光监测：孵育后，使用荧光显微镜或酶标仪进行荧光测量。
4. 定量分析：通过荧光强度量化酶活性，评估处理或分化过程中碱性磷酸酶的变化。
四、组织切片中的碱性磷酸酶检测
1. 组织切片制备：使用常规的组织学方法制备组织切片。
2. 加入4-MUP：将切片浸泡在4-MUP溶液中，通常在37°C孵育。
3. 荧光显微镜观察：孵育后，使用荧光显微镜观察荧光信号。
5. 分析：通过观察组织中的荧光分布和强度，评估碱性磷酸酶的活性。