TMB dihydrochloride (Sure Blue TMB dihydrochloride) is an enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) and an excellent colorimetric substrate for the detection of horseradish peroxidase (HRP)-labeled probes used in staining procedures immunohistochemistry.

使用方法
一、溶液配制
1. TMB底物溶液：Sure Blue TMB Dihydrochloride通常以浓缩溶液提供，使用时需要根据实验要求进行稀释。底物溶液的标准浓度为1x，通常将浓缩溶液与适当的溶剂（如去离子水）按比例稀释。使用前，请参考厂家说明书进行准备。
2. 过氧化氢溶液：TMB的反应通常需要过氧化氢作为氧化剂。过氧化氢溶液的浓度通常为0.01%-0.03%。过高或过低的浓度可能会影响反应的灵敏度。
二、免疫组化（IHC）应用
1. 抗体孵育：将样品（如切片或细胞）与一抗（特定的抗体）孵育，通常在4°C下孵育过夜，随后用PBS洗涤。
2. HRP标记二抗孵育：将二抗（与HRP结合的二级抗体）加入样品中，孵育30分钟至1小时。
3. 显色反应：将TMB底物溶液与过氧化氢溶液混合并加入样品中。显色反应一般持续10-30分钟，具体时间取决于目标蛋白的表达水平和实验需求。
4. 停止反应：当蓝色或绿色产物的颜色达到理想强度时，使用停止液（例如0.5 M硫酸）停止反应。
5. 显微镜观察：在显微镜下观察样品，目标区域应显示出蓝色或绿色的染色。
三、 酶联免疫吸附试验（ELISA）应用
1. 封闭：使用适当的封闭液封闭微孔板（例如5% BSA或牛血清白蛋白，BSA），避免非特异性结合。
2. 抗体孵育：将样品（如血清）与包被有抗原的微孔板中的一抗孵育，孵育1小时。
3. HRP标记二抗孵育：用与HRP结合的二抗孵育样品，通常孵育30分钟至1小时。
4. 显色反应：加入预先配制好的TMB底物溶液（TMB与过氧化氢的混合液），并让反应发生。反应通常持续5-15分钟，直至蓝色或绿色产物形成。
5. 停止反应：加入停止液（例如2 M硫酸），停止反应，蓝色反应液会变为黄色。
6. 吸光度测定：使用分光光度计测定在450 nm波长下的吸光度值，吸光度与抗体浓度成正比。
注意事项：
1. 显色反应的时间和温度需要根据样品和实验条件进行优化。通常建议在室温下孵育10-30分钟，但某些情况下，反应时间也可以根据实际需要适当延长或缩短。
2. 过长的反应时间可能会导致背景染色或颜色过于浓烈，因此需要进行监控并确保在最佳反应时间内停止反应。