Nitro blue tetrazolium chloride (NBT) is a NADPH-diaphorase substrate that competitively inhibits nitric oxide synthase (IC50 = 3-4 M). A well-known scavenger of superoxide anions.Nitro blue tetrazolium chloride, a substrate for dehydrogenases, is used with the alkaline phosphatase substrate BCIP in western blotting and immunohistological staining procedures.

Nitric oxide (NO):3-4 M

使用方法
一、溶液制备
1.NBT 储备液：将 NBT 溶解在蒸馏水或适当的缓冲液中（如 70% 二甲基甲酰胺，DMF）。常用浓度：50–75 mg/mL。储备液需避光存放，存储于 -20°C 下。
BCIP 储备液：将 BCIP 溶解在二甲基甲酰胺（DMF）或水中。常用浓度：50 mg/mL。储存于 -20°C，并避光保存。
2.工作液：实验前立即新鲜配制工作液，将 NBT 和 BCIP 添加到合适的检测缓冲液中（例如 Tris 缓冲盐溶液 (TBS)，pH 9.5），最终浓度如下：
NBT：0.1–0.5 mg/mL；
BCIP：0.05–0.3 mg/mL。
注意事项：配制后的工作液应立即使用，以避免活性下降。
二、操作步骤
1. Western Blotting：
(1) 将蛋白转移到膜（如硝酸纤维素膜或 PVDF 膜）后，使用封闭缓冲液（如 TBS 含 5% BSA）封闭非特异性结合位点。
(2) 加入针对目标蛋白的一抗孵育，再用结合碱性磷酸酶的二抗孵育膜。
(3) 彻底清洗以去除未结合的抗体。
(4) 加入新鲜配制的 NBT/BCIP 工作液。
(5) 在暗处于 室温 孵育，直到显色达到所需程度（通常 5–30 分钟）。
(6) 使用水或 Tris-EDTA 缓冲液终止反应，并保存结果。
2.免疫组织化学（IHC）：
(1) 对组织切片进行固定，并用封闭缓冲液阻断非特异性结合。
(2) 使用目标蛋白的特异性一抗孵育组织切片，然后使用结合碱性磷酸酶的二抗。
(3) 彻底清洗切片。
(4) 添加 NBT/BCIP 工作液，观察显色反应。
(5) 显色达到理想强度后，用水终止反应。若需要，可对切片进行对比染色（如苏木素染核）。
3. 酶活性检测：
(1) NBT 常用于检测脱氢酶活性。脱氢酶将 NBT 还原，生成深蓝色的不溶性甲臜（formazan）产物。
(2) 在酶反应缓冲液中加入适当的辅底物（如 NADH 或 FADH）。
(3) 添加 NBT，并监测比色变化（使用分光光度计或肉眼观察）。
注意事项：
1.光敏性：NBT 对光敏感，实验过程中应尽量减少其暴露在光下，并避光存储。
2.操作安全性：避免与皮肤直接接触或吸入。实验时佩戴适当的个人防护装备（PPE）。
3.优化实验条件：反应时间和试剂浓度应根据具体实验条件进行优化，以获得最佳结果。
4.兼容性：NBT/BCIP 底物系统特异性检测碱性磷酸酶活性。实验体系中应避免其他可能干扰该检测系统的酶或试剂。