方法：采用体外结合实验检测 DI-591与 DCN 家族蛋白的亲和力；在 KYSE70、THLE2 细胞中分别研究其蛋白结合、下游基因及蛋白表达影响；通过敲低实验探究其对 cullin neddylation 及 NRF2 通路的调控机制。
结果：DI-591 可结合 DCN1、DCN2，Ki 分别为 12 nM、10.4 nM，对 DCN3‑5 无明显结合，对 DCN1/2 的选择性高于 DCN3‑5 达 1000 倍以上 。
DI-591（0–10 μM，1 h）可结合 KYSE70 细胞内 DCN1/2，并破坏 DCN1 与 UBC12 的相互作用 。
DI-591（10 μM，24 h）处理 THLE2 细胞可显著上调 NQO1、HO1 mRNA 及 HO1 蛋白水平，对 NRF2 mRNA 无影响 。
DI-591 选择性抑制 Cullin 3 的 neddylation，进而促进 NRF2 蛋白积累并激活其转录；敲低实验显示 DCN1（而非 DCN2）特异性调控 Cullin 3 的 neddylation。DI-591 可作为优质探针化合物，用于研究 Cullin 3 型 CRL 泛素连接酶在生物学过程及人类疾病中的作用 [1]。