Cy5 maleimide (Cyanine5 maleimide) is a highly sensitive anatase dye for the detection of free thiols in natural protein extracts.

使用方法
一、溶液制备
1. 储备液：将 Cy5 Maleimide 溶解于适当的溶剂中，如二甲基亚硫酰胺（DMSO）或二甲基甲酰胺（DMF）。常用储备液浓度：1–10 mM。在-20°C存储，避光保存，防止光降解。
2. 工作溶液：将储备液稀释至所需浓度（例如 1–50 µM），使用适当的缓冲液（如 PBS 或 HEPES 缓冲液，pH 7.使用时新鲜配制，确保最佳标记效果。
二、使用 Cy5 Maleimide 进行硫醇标记操作步骤
1. 蛋白样品准备：
1）使用适当的蛋白提取缓冲液（如 RIPA 缓冲液或 PBS）从细胞或组织中提取蛋白质。
2）确保蛋白样品中没有其他可能与 Cy5 Maleimide 反应的基团（如氨基或羧基），以避免干扰标记过程。
2. 标记反应：
1）将 Cy5 Maleimide 与蛋白样品混合，使用适当的缓冲液（如 PBS，pH 7.4）。
2）在室温下孵育 30 分钟至 1 小时，使染料与蛋白质中的游离硫醇基团反应。
3）Cy5 Maleimide 与蛋白质的典型摩尔比为 1:1 到 10:1，具体根据所需标记水平进行调整。
3. 终止和纯化：
1）反应完成后，通过加入含硫醇的试剂（如二硫苏糖醇（DTT）或三（2-氨基乙基）膦（TCEP））来终止标记反应。
2）使用透析、尺寸排阻色谱或亲和纯化等方法纯化标记后的蛋白质，去除多余的染料。
4. 细胞及成像应用
细胞成像：
(1) 通过使用 Cy5 Maleimide 标记的生物分子或直接在 SPAAC/CuAAC 标记中对活细胞或固定细胞进行标记。
(2) 使用 PBS 洗涤细胞，去除未结合的染料。
(3) 使用共聚焦显微镜或荧光显微镜分析荧光信号，选择适合 Cy5 的滤光片组（激发波长：646 nm，发射波长：662 nm）。
组织成像：
(1) 使用 Cy5 Maleimide 标记的探针对组织切片进行染色。
(2) 彻底洗涤切片以去除背景荧光。
(3) 使用荧光显微镜或全片成像系统进行分析。
体内成像：
(1) 将 Cy5 Maleimide 标记的探针注入动物模型。
(2) 使用体内成像系统（如 IVIS）或类似平台进行近红外荧光成像。
(3) 监测标记探针的分布、靶向和清除过程。
注意事项
1. 光敏性：Cy5 Maleimide 对光敏感，应避免长期暴露在光照下，并存储在避光环境中。
2.反应优化：根据实验条件优化染料浓度、反应时间和缓冲液条件，以实现高效标记和减少背景。
3.铜毒性（对于 CuAAC）：铜离子可能影响生物样本，因此应仔细控制铜浓度，或在铜毒性问题上选择 SPAAC 反应。
4.稳定性：储备液应分装以避免反复冻融，保持溶液的活性。