经过3天的存活后，所有通过WGA-HRP逆向标记的老鼠均通过注射过量的硫酸戊巴比妥(100 mg/kg)深度麻醉，并接着用100 ml 0.01 M PBS (pH 7.4)和500 ml含4%甲醛和0.01%戊二醛在0.1 M PB (pH 7.4)的固定液灌注。随后，取出脊髓并将其在含4%甲醛的0.1 M PB (pH 7.4)中于4°C保存2-4小时。挑选完整切片进行TMR和Endomorphin-2(EM-2)或MOR双重染色。切片首先用10%正常山羊血清在0.01 M PBS (pH 7.4)中封闭，然后在室温下与豚鼠抗TMR（1:500）和兔抗EM-2（1:200）或兔抗MOR（1:500）抗体孵育24小时。洗涤后，在室温下用以下混合物孵育8小时：(1)亚硝酸生物素化驴抗兔IgG（1:500）和Alexa594标记的驴抗豚鼠IgG（1:500），稀释于PBS-NDS（用于TMR和EM-2染色）；(2)亚硝酸生物素化驴抗兔IgG（1:500）和Alexa488标记的驴抗豚鼠IgG（1:500），稀释于PBS-NDS（用于TMR和MOR染色）。随后，切片在含0.5%Triton X-100的0.01 M PBS (PBS-X)中，使用FITC-Avidin（1:1,000）（对于EM-2染色）或Alexa594-Avidin（1:1,000）（对于MOR染色）孵育3小时。最终，在0.01 M PBS中清洗后，切片被安置于干净的玻璃载玻片上，自然干燥后，用含50% (v/v)甘油和2.5% (w/v)三乙烯二胺的0.05 M PBS混合物覆盖。使用激光扫描共聚焦显微镜捕获图像。