Protein A/G Agarose

Name: Protein A/G Agarose
Brand: TargetMol
SKU: C0132
Rating: 5 (4 reviews)

产品编号 C0132 Protein A/G Agarose

TargetMol 的 Protein A/G 琼脂糖凝胶将 Protein A/G 高密度定向偶联到高度交联的琼脂糖凝胶微球表面，具备优异的抗体结合能力和较低的非特异性蛋白吸附率。
TargetMol 的 Protein A/G 琼脂糖凝胶适用于蛋白质及蛋白质复合物的免疫沉淀（IP）和免疫共沉淀（Co-IP），也可用于抗体的纯化。本品适用于细胞裂解物、细胞分泌上清、血清、腹水等样品中抗原的免疫沉淀反应。
本产品规格为溶液总体积。

规格	价格	库存	数量
5 mL	¥ 423	5日内发货

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实验操作小课堂

Protein A/G Agarose产品问题解答

问Protein A/G、Protein A、Protein G 和 Protein L 的区别是什么？

答Protein A：与IgG的Fc区高亲和结合，适合大多数哺乳动物IgG，尤其是人、兔、小鼠IgG1。 Protein G：结合范围更广，可结合大多数IgG亚型和部分Protein A无法结合的抗体，如鼠IgG3。 Protein A/G：兼具Protein A和Protein G的结合特点，结合范围最广，适合多种抗体。 Protein L：结合轻链κ，适合部分不含Fc区的抗体（如Fab片段）和某些多克隆抗体。

问如何纯化抗体 Fab 片段？

答a. Protein L可特异性结合抗体的κ轻链，因此，只要Fab片段中包含κ轻链，就可以利用Protein L琼脂糖凝胶进行纯化。 b. Protein G不仅能特异性结合IgG的Fc片段，还能够低亲和力地结合某些抗体的Fab片段，可作为纯化Fab的选择。 c. Protein A仅结合IgG的Fc片段，因此可以采用流穿模式纯化Fab片段。将纯化后的IgG酶解后加载到Protein A琼脂糖凝胶上，Fab片段会随流穿峰流出，而Fc片段则结合在琼脂糖凝胶上。

问抗体洗脱后纯度不高该如何解决？

答a. 检查洗杂是否彻底。建议收集最后几次洗杂液，通过SDS-PAGE电泳进行分析，确认是否有杂质残留。 b. 优化结合和洗杂条件。在结合步骤中适当提高盐离子浓度，或在洗杂液中添加低浓度非离子型去污剂（如Triton X-100），以减少非特异性吸附。 c. 样品预处理。在上样前对样品进行预处理，去除一些杂质，例如通过离心或过滤去除颗粒和沉淀物。 d. 采用两步纯化策略：第一步：使用亲和层析（如Protein A或Protein G）去除大部分杂质。第二步：结合离子交换层析进一步纯化，可有效去除宿主细胞蛋白（HCP）、脱落的Protein A，以及抗体聚体等杂质，从而获得更高纯度的抗体。

常见问题解答

问在做加药实验时，药物对 CCK8 测定是否有影响？如何解决？

答有时会有影响。如果药物具有还原性，会和 CCK-8 发生显色反应，增加吸光度。解决办法：首先要确认药物是否有吸收，在含有药物的培养基中加入 CCK-8，测定 450 nm 的吸光度，如果它的吸光度比不含药物的培养基 (加 CCK-8)的吸光度高，则证明药物有影响，可在加 CCK-8 之前更换培养基，去掉药物的影响。

问TargetMol蛋白酶抑制剂是否可以和其他公司的磷酸酶抑制剂一起使用？

答可以一起使用。

问Cocktail 系列的使用方法？

答在室温下解冻，开盖前请低速离心一下，以便将黏附于管壁的液体甩至管底。然后在实验前以 1:100（v/v）稀释至溶液样品（细胞裂解液或组织提取液）。

问使用 CCK8 进行实验后，发现读值低，不变色、没差异等，应该怎么办？

答CCK8 在孵育 1-4 小时后，OD 读值在 1-2 之间为佳，线性关系比较好。关于 CCK8 的使用问题，通常建议调整细胞状态、增加种板数量、改变加药浓度、延长孵育时间等。

问蛋白酶抑制剂 cocktail C0001 使用时加到蛋白液中的有效抑制时间有多久？

答这个我们暂时没有准确的数据，因为它对不同样品不同蛋白的保护程度是不一样的。一般单次提取以后，不加蛋白酶抑制剂 cocktail 的样品蛋白会在 24 h 后发生明显降解，加了蛋白酶抑制剂 cocktail 的样品蛋白可以维持 48 h 不降解。如果提取后置于 -20℃ 储存的话，一般加了蛋白酶抑制剂 cocktail 的样品蛋白可以至少储存一个月，冻融三次；但时间长了或者冻融次数多了的话，蛋白还是会发生降解的，不同蛋白降解时间不一样的。

产品特点

物理化学稳定性良好
配基不易脱落
耐用性强
使用便捷

产品应用

蛋白质及蛋白质复合物的IP、Co-IP、ChIP和RIP。
抗体纯化。

产品信息

Protein A/G 琼脂糖凝胶	特性
基质	高度交联的4%琼脂糖凝胶
粒径	30-100 μm
配体	重组Protein A/G蛋白
结合能力	≥25 mg hIgG/mL 凝胶
浓度	25%（v/v）

操作说明

一、缓冲液准备
以下为常用的缓冲液成分，使用前建议用 0.22 μm 或 0.45 um 滤膜过滤：
1)平衡/洗杂液：0.15 M NaCl, 20 mM Na2HPO4, pH7.0
2)酸性洗脱液：0.1 M glycine, pH3.0
3)中和液：1 M Tris-HCl, pH8.0

二、蛋白纯化
1. 抗体吸附
1)取适量的Protein A/G 琼脂糖凝胶加入2 mL离心管中，1000 rpm离心5 min，弃去上清。
2)加入0.5 mL平衡液，悬浮凝胶（确保凝胶与目标蛋白处于相同的缓冲体系中，保护蛋白），1000 rpm 离心5 min，弃去上清。重复此操作两次。
3)向平衡好的凝胶中加入抗体溶液，悬浮混合，室温下在翻转混合仪或手动轻轻翻转30 min，1000 rpm 离心5 min，收集上清液以备后续检测。
4)加入0.5 mL洗杂液，悬浮凝胶清洗以去除非特异性吸附的杂蛋白，1000 rpm离心5 min，弃去上清。重复两次。

2. 抗体交联（可选）
若需将抗体与抗原复合物共同洗脱，可跳过此步骤，直接进行下一步。对于50 μL-1 mL的凝胶量，以下步骤无需增加交联液体积。
1)向清洗后的凝胶中加入1 mL交联液（0.2 M三乙醇胺，pH 8.2），1000 rpm离心5 min，弃去上清。
2)加入1 mL含20 mM DMP（dimethyl pimelimidate dihydrochloride）的交联液，现用现配，悬浮凝胶并在室温下翻转混合30 min，1000 rpm离心5 min，弃去上清。
3)加入1 mL终止液（50 mM Tris，pH 7.5），悬浮凝胶，在室温下翻转混合15 min后，1000 rpm离心5 min，弃去上清以终止交联。
4)加入0.5 mL洗杂液，悬浮凝胶并清洗，1000 rpm离心5 min，弃去上清。重复两次。

3. 抗原沉淀反应
1)抗原吸附：将含抗原的样品加入到凝胶-抗体复合物中，用移液器轻轻混匀。在室温下翻转混合10 min，以便抗原与抗体充分结合。若结合力较弱，可延长至室温反应1 h，或在4℃下过夜反应。
2)洗杂：1000 rpm离心5 min收集上清液，冰上保存以备检测。加入1 mL洗杂液，轻轻混匀悬浮后离心1000 rpm 5 min，弃去上清。重复洗涤两次。最后将凝胶-抗体-抗原复合物悬浮转移至新的1.5 mL离心管，1000 rpm离心5 min，弃去上清。
3)抗原洗脱：提供两种洗脱方法，根据后续检测选择合适的方案。
a)变性洗脱法：适用于SDS-PAGE检测。加入25 μL 1×SDS-PAGE Loading Buffer，混匀后于95℃加热5 min。1000 rpm离心5 min，收集上清用于SDS-PAGE电泳及后续Western Blot分析。
b)非变性洗脱法：保持抗原生物活性，适用于功能分析。加入5倍柱体积的酸性洗脱液，用移液器轻轻吹打5次以混匀。室温下翻转混合10 min后，1000 rpm离心5 min，收集上清作为目标抗原，将洗脱组分转移至新管，立即加入1/10体积的中和液，将pH调至7.0-8.0，以便后续功能分析。

三、免疫沉淀
1. 抗原抗体结合
将抗体与含有目标蛋白的裂解液混合，在室温下轻微震荡孵育30-60 min，或在2-8℃环境下孵育过夜。具体孵育条件需根据抗原-抗体的结合效率和抗原的稳定性进行优化，以便形成稳定的抗原-抗体复合物。
注：抗体的加入量应根据后续凝胶的用量进行适当调整，过量的抗体可能会影响复合物与凝胶的结合效果，建议抗体用量不超过凝胶最大载量的80%。

2. 凝胶准备
1)取适量的Protein A/G 琼脂糖凝胶加入2 mL离心管中，1000 rpm离心5 min，弃去上清。
2)加入0.5 mL平衡液，悬浮凝胶（确保凝胶与目标蛋白处于相同的缓冲体系中，保护蛋白），1000 rpm 离心5 min，弃去上清。重复此操作两次。

3. 抗原-抗体复合物的吸附
将步骤1中制备的抗原-抗体复合物加入到已处理好的凝胶中，轻轻混合，在室温下翻转混合以确保充分接触并吸附，约30 min后，1000 rpm离心5 min，收集上清液以备后续检测。

4. 洗杂
加入0.5 mL洗杂液，轻轻悬浮凝胶进行洗涤，以去除非特异性吸附的杂蛋白。1000 rpm离心5 min，弃去上清，重复两次。

5. 抗原洗脱：
提供两种洗脱方法，根据后续检测选择合适的方案。
1)变性洗脱法：适用于SDS-PAGE检测。加入25 μL 1×SDS-PAGE Loading Buffer，混匀后于95℃加热5 min。1000 rpm离心5 min，收集上清用于SDS-PAGE电泳及后续Western Blot分析。
2)非变性洗脱法：保持抗原生物活性，适用于功能分析。加入5倍柱体积的酸性洗脱液，用移液器轻轻吹打5次以混匀。室温下翻转混合10 min后，1000 rpm离心5 min，收集上清作为目标抗原，将洗脱组分转移至新管，立即加入1/10体积的中和液，将pH调至7.0-8.0，以便后续功能分析。