蛋白质变性：一般来说，蛋白质需要变性和双硫键断裂后，酶解消化才能完成，Proteinase K 对变性蛋白质和天然蛋白质都有很强的蛋白水解活性。
1、将 1-10 mg 的靶蛋白溶解于 6 M guanidine-HCl (或 6-8 M urea)、50 mM Tri-HCI (pH 8)、2-5 mM DTT (或 β-mercaptoethanol) 中的 1 mL (最小 25 µL) 的反应液中。
2、在 95℃ 下加热 15-20 min 或在 60℃ 下加热 45-60 min。如果需要消化较少的蛋白质，则可以按比例缩小所给的推荐条件。
3、变性后，让反应冷却并加入 50 mM Tris-HCl (pH 7.5)，5 mM CaCl，直到 guanidine-HCl 或 urea 浓度低于 2 M。
蛋白酶消化：向反应中加入 Proteinase K ，使最终浓度为 50-100 µg/mL。在 37-56℃ 下至少加热 1 h。
为了终止反应，加入 Proteinase K 的抑制剂，如 PMSF 或 DFP。反应也可以通过加入终浓度为 2 mM 的 EGTA (pH 8) 或 TCA 沉淀来终止。Proteinase K 不能被 EGTA 完全灭活，因为该酶在无钙时仍保留部分活性。热处理 (65℃，10-15 min) 仅能部分灭活 Proteinase K，抑制率不超过 20-25%。
蛋白裂解和核酸酶去除：Proteinase K 可用于裂解天然蛋白质和去除 DNA 或 RNA 制剂中的核酸酶。如果需要消化非变性 (天然) 蛋白，请在 50 mM Tris-HCI (pH 7.5)、5 mM CaCl 或另一种与目标蛋白质稳定性相容的缓冲液中，将蛋白质与 Proteinase K (浓度为50-100 µg/mL) 在 37-56℃ 下孵育。
为了从 DNA/RNA 制剂中去除核酶，用 Proteinase K 在温度为 37℃ 下，在 0.01 M Tris (pH7.8)、5 mM EDTA、0.5% SDS下，用浓度为 50 µg/mL 的 Proteinase K 培养核酸。