2',7'-Dichlorofluorescein diacetate (Diacetyldichlorofluorescein), a cell-permeable fluorogenic probe, is useful for the detection of nitric oxide (NO) and reactive oxygen species (ROS) and for the determination of the degree of overall oxidative stress.

一、检测活性氧 (Reactive Oxygen Species, ROS)
1. 材料准备
1）DCFH-DA 探针溶液： 配制 DCFH-DA 储备液（1–10 mM），溶解于无水 DMSO 中，避光保存。
2）细胞样品： 待测的活细胞或组织样本。
3）PBS 缓冲液： 用于洗涤细胞，pH 7.4。
2. 实验步骤
1） 细胞处理： 收集待测细胞，用 PBS 清洗 2-3 次，去除培养基中的干扰物。
2） 染色： 将 DCFH-DA 稀释至0.1–20 µM，加入细胞培养液中，37°C 孵育 30 分钟，避光处理。
3） 清洗： 孵育后，用 PBS 缓冲液洗涤细胞，去除未进入细胞的 DCFH-DA。
4）检测荧光： 使用荧光显微镜或流式细胞仪检测荧光信号。
激发波长： 488 nm
发射波长： 525 nm
二、检测一氧化氮 (Nitric Oxide, NO)
DCFH-DA 通过间接机制检测 NO 的存在，具体取决于 NO 生成的次级产物（如过氧亚硝酸盐）。
实验步骤与 ROS 检测类似，适用于 NO 含量变化的间接评估。
三、总氧化应激评估
1）将荧光信号与标准曲线对比，定量测定 ROS 或 NO 的水平。
2）使用空白组（未处理 DCFH-DA 的细胞）和阳性对照（如 H2O2 或 NO 捐赠剂处理组）验证实验结果的可靠性。