RuBisCO Assay Kit (Microanalysis)

在 Rubisco 的催化下，1 分子的核酮糖-1，5-二磷酸（RuBP）与 1 分子的 CO₂ 结合，产生 2 分子的 3-磷酸甘油酸（PGA）；PGA 可通过外加的 3-磷酸甘油酸激酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶的作用，产生甘油醛-3-磷酸，伴随着 NADH 氧化生成 NAD⁺；在 340 nm NADH 有特征吸收峰，而 NAD⁺ 没有此吸收峰，因此测定 340nm 吸光度下降速率可以代表 Rubisco 的羧化酶活性。

100T/96S规格的产品组成及保存条件：

正式测定前务必取2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

一、自备用品：
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板（UV板）、研钵、冰和蒸馏水。

二、粗酶液制备
1.按照组织质量（g）：CB0186M-ES体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL CB0186M-ES），进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2.细菌或细胞样本的制备：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每 500 万细菌或细胞加入 1mL CB0186M-ES，超声波破碎细菌或细胞（功率 20%，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；10000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

三、测定步骤：
1.分光光度计/酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。
2.工作液在25℃孵育5min；
3.在微量石英比色皿或 96 孔板中依次加入下列试剂：

四、RuBisCO 活性计算：
a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下：
1.按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化1 nmol NADH为一个酶活力单位。
RuBisCO 活力 (U/mg prot) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr) ÷T = 344×ΔA÷Cpr
2.按样本鲜重计算：
单位的定义：25℃中每 g 组织每分钟氧化1nmol NADH为一个酶活力单位。
Rubisco 活力(U/g 鲜重) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W×V样÷V样总)÷T = 344×ΔA÷W
3.按细菌或细胞数量计算：
单位的定义：25℃中每1万个细菌或细胞每分钟氧化1nmol NADH为一个酶活力单位。
Rubisco活力(U/10⁴ cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹ ]÷(V样÷V样总×500) ÷T=0.69×ΔA
注： V反总：反应体系总体积，2.14×10^-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.02 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，5 min；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万；10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol

b. 使用 96 孔板(UV板)测定的计算公式如下：
将上述公式中光径d-1cm改为d-0.5cm(96孔板光径)进行计算。

1.蛋白定量测定，建议使用TargetMol生产的BCA Protein Quantification Kit (C0050)。
2.本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
3.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。