PLD Assay Kit (Microanalysis)

磷脂酶D催化水解磷脂酰胆碱末端的磷脂酰二酯键生成磷脂酸和胆碱，胆碱在胆碱氧化酶催化作用下生成甜菜碱和过氧化氢，过氧化氢在过氧化氢酶的作用下将4-氨基安替比林和重蒸酚氧化成粉红色物质，在500nm处有特征吸收峰。

100T/96S规格的产品组成及保存条件： 

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

一、自备用品：
可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、天平、研钵、超速冷冻离心机、恒温水浴锅、无水乙醇。

二、酶液提取
1.组织：按照质量（g）：提取液体积（mL）为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL CB0285M-ES）加入CB0285M-ES，冰浴匀浆后于4℃，10000g离心5min，取全部上清于4℃、100000g离心30min，弃上清，取沉淀溶于1mL CB0285M-A。
2.细胞：按照细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL CB0285M-ES），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后于4℃，10000g离心5min，取全部上清于4℃、100000g离心30min，弃上清，取沉淀溶于1mL CB0285M-A。
3.血清：直接测定。

三、测定步骤：
1.分光光度计/酶标仪预热30 min，调节波长到500nm，蒸馏水调零。
2.样本测定（在EP管中加入）

四、PLD酶活计算公式：
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1.按照蛋白浓度计算：
酶活性定义：每毫克蛋白每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量为一个酶活力单位。
PLD活性 (U/mg prot) = (A测定管÷A标准管)×C标准÷Cpr÷T = 16.7×(A测定管÷A标准管)÷Cpr
2.按照样本质量计算：
酶活性定义：每克组织每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量为一个酶活力单位。
PLD活性 (U/g 鲜重) = (A测定管÷A标准管)×C标准÷W÷T = 16.7×(A测定管÷A标准管)÷W
3.按照细胞数量计算
酶活性定义：每10⁴个细胞每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量为一个酶活力单位。
PLD活性 (U/10⁴ cell) = (A测定管÷A标准管)×C标准÷细胞数量÷T = 16.7×(A测定管÷A标准管)÷细胞数量
4.按照液体体积计算
酶活性定义：每毫升血清每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量为一个酶活力单位。
PLD活性 (U/mL) = (A测定管÷A标准管)×C标准÷T=16.7×(A测定管÷A标准管)
注：C标准：标准品浓度，500nmol/mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g/mL；T：反应时间，30min。

b. 用96孔板测定的计算公式如下
1.按照蛋白浓度计算
酶活性定义：每毫克蛋白每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量为一个酶活力单位。
PLD活性 (U/mg prot) = (A测定管÷A标准管)×C标准÷Cpr÷T = 16.7×(A测定管÷A标准管)÷Cpr
2.按照样本质量计算
酶活性定义：每克组织每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量为一个酶活力单位。
PLD活性 (U/g 鲜重) = (A测定管÷A标准管)×C标准÷W÷T = 16.7×(A测定管÷A标准管)÷W
3.按照细胞数量计算
酶活性定义：每10⁴个细胞每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量为一个酶活力单位。
PLD活性 (U/10⁴ cell) = (A测定管÷A标准管)×C标准÷细胞数量÷T = 16.7×(A测定管÷A标准管)÷细胞数量
4.按照液体体积计算
酶活性定义：每毫升血清每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量为一个酶活力单位。
PLD活性 (U/mL) = (A测定管÷A标准管)×C标准÷T=16.7×(A测定管÷A标准管)
注：C标准：标准品浓度，500nmol/mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g/mL；T：反应时间，30min。

1.蛋白定量测定，建议使用TargetMol生产的BCA Protein Quantification Kit (C0050)。
2.显色完成后，若有沉淀，于8000rpm，25℃离心5min后取上清测定。
3.吸光值不宜超过1，否则用试剂A将酶液进行稀释，并在计算公式中乘以稀释倍数。
4.本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
5.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。