Phosphofructokinase Assay Kit (Microanalysis)

PFK 催化果糖-6-磷酸和 ATP 生成果糖-1,6-二磷酸和 ADP，丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步 依次催化 NADH 氧化生成 NAD⁺，在 340nm 下测定 NADH 下降速率，即可反映 PFK 活性。

100T/96S规格的产品组成及保存条件：

正式测定前务必取2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

一、自备用品：
紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、水浴锅、可调式移液枪、研钵、冰和双蒸水。

二、粗酶液提取：
1.细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴ 个）：CB0127M-ES（mL）为 500~1000：1 的比例，建议 500 万细菌或细胞加入 1mL CB0127M-ES，超声波破碎细菌或细胞。（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；然后8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2.组织：按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
3.血清（浆）样品：直接检测。

三、测定步骤：
1.紫外分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。
2.试剂准备见产品组成及保存条件列表。
3.样本测定，依次在微量石英比色皿或 96 孔板中加入下列试剂：

四、PFK酶活性计算：
a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1.血清(浆)PFK 活力的计算：
单位的定义：每毫升血清(浆)每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmol ATP 转化为 1nmol 果糖-1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。
计算公式：PFK (nmol/min/mL) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷V样÷T = 321×ΔA
2.组织、细菌或细胞中 PFK 活力计算：
(1)按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmol ATP 转化为 1nmol 果糖-1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。
计算公式：PFK (nmol/min/mg prot) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr) ÷T = 321×ΔA÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
单位的定义：每 g 组织每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmol ATP 转化为 1nmol 果糖-1,6- 二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。
计算公式：PFK (nmol/min /g 鲜重) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W ×V样÷V样总)÷T = 321×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmol ATP 转化为 1nmol果糖-1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。
计算公式：PFK (nmol/min /10⁴ cell) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V样÷V样总)÷T = 0.642×ΔA
注： V反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.01 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，10 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量(g)；500：细菌或细胞 总数，500 万。
b. 用 96 孔板测定的计算公式如下
1.血清(浆)PFK 活力的计算：
单位的定义：每毫升血清(浆)每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 转化为 1nmol果糖-1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。
计算公式：PFK (nmol/min/mL) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷V样÷T = 642×ΔA
2.组织、细菌或细胞中 PFK 活力计算：
(1)按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 转化为 1nmol 果糖-1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。
计算公式：PFK (nmol/min /mg prot) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr) ÷T = 642×ΔA÷Cpr
(1)按样本鲜重计算：
单位的定义：每 g 组织每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 转化为 1nmol 果糖-1,6- 二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。
计算公式：PFK (nmol/min /g 鲜重) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W× V样÷V样总)÷T = 642×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 转化为 1nmol果糖-1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。
计算公式：PFK (nmol/min /10⁴ cell) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V样÷V样总)÷T =1.284×ΔA
注： V反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：96 孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.01 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，10 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量(g)；500：细菌或细胞 总数，500 万。

1.比色皿中反应液的温度必须保持 37℃或 25℃，取小烧杯一只装入一定量的 37℃或 25℃ 蒸馏水，将此烧杯放入 37℃或 25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中预热。
2.不同匀浆组织中 PFK 活力不一样，做正式试验之前请做 1-2 只预试，若 ΔA>0.5，则 说明活力太高，必须用CB0127M-ES 稀释成适当浓度匀浆上清液（计算公式中乘以相应稀释倍数），或缩短反应时间至 2min 或 5min，使 ΔA<0.5，以提高检测灵敏度。
3.最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。
4.本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
5.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。