Phosphofructokinase Assay Kit (UV Spectrophotometry)

Name: Phosphofructokinase Assay Kit (UV Spectrophotometry)
Brand: TargetMol
SKU: CB0127UV
Rating: 5 (4 reviews)

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产品编号 CB0127UV

别名 磷酸果糖激酶（PFK）活性检测试剂盒（紫外分光光度法）

磷酸果糖激酶（Phosphofructokinase, PFK; EC 2.7.1.11）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，负责将果糖-6-磷酸和 ATP 转化为果糖-1,6 二磷酸和 ADP，是糖酵解过程的关键调节酶之一。

规格	价格	库存	数量
50 T	¥ 1,253	10-12日内发货

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实验操作小课堂

常见问题解答

检测原理

PFK 催化果糖-6-磷酸和 ATP 生成果糖-1,6-二磷酸和 ADP，丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化 NADH 氧化生成 NAD⁺，在 340nm 下测定 NADH 下降速率，即可反映 PFK 活性。

产品规格

50T/48S规格的产品组成及保存条件：

编号	规格	储存条件
CB0127UV-ES	60ml×1 瓶	4℃保存；
CB0127UV-A	45ml×1 瓶	4℃保存；
CB0127UV-B	粉剂×1 瓶	-20℃保存；临用前加入 2.8mL 双蒸水充分溶解备用，-20℃分装保存，避免反复冻融；
CB0127UV-C	粉剂×1 支	-20℃保存；临用前加入 3ml 蒸馏水充分溶解备用，-20℃分装保存，避免反复冻融；
CB0127UV-D	粉剂×1 支	-20℃保存；临用前加入 3ml 蒸馏水充分溶解备用，-20℃分装保存，避免反复冻融；
PFK 工作液（可测25个样）的配制：取 20mL CB0127UV-A和 1.32mL CB0127UV-B充分混匀，现用现配。

正式测定前务必取2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

操作说明

一、自备用品：
紫外分光光度计、1ml石英比色皿、水浴锅、可调式移液枪、研钵、冰和双蒸水。

二、粗酶液提取：
1.细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：CB0127UV-ES（mL）为 500~1000：1 的比例，建议 500 万细菌或细胞加入 1mL CB0127UV-ES，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；然后8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2.组织：按照组织质量（g）：CB0127UV-ES体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
3.血清（浆）样品：直接检测。

三、测定步骤：
1.紫外分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。
2.试剂准备见产品组成及保存条件列表。
3.样本测定，依次在1 mL石英比色皿中加入下列试剂：

试剂名称	测定管（µL）
PFK 工作液	850
样本	50
CB0127UV-C	50
CB0127UV-D	50
将上述试剂按顺序加入 1 mL 石英比色皿中，加CB0127UV-D的同时开始计时；在 340 nm 波长下记录 20 秒时的初始吸光度 A1，比色后迅速将比色皿连同反应液一起放入 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴中，准确反应 10 分钟；迅速取出比色皿并擦干，340 nm 下比色，记录 10分20秒时的吸光度 A2，计算∆A=A1-A2。

四、PFK酶活性计算：
1.血清(浆)PFK 活力的计算：
单位的定义：每毫升血清(浆)每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmol ATP 转化为 1nmol 果糖-1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。
计算公式：PFK (U/mL) = [△A×V反总÷(ε×d)×10⁹ ] ÷V样÷T = 321×△A
2.组织、细菌或细胞中 PFK 活力计算：
(1)按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmol ATP 转化为1nmol 果糖-1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。
计算公式：PFK (U/mg pro) = [△A×V反总÷(ε×d)×10⁹ ] ÷(Cpr×V样)÷T = 321×△A ÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
单位的定义：每 g 组织在反应体系中每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmol ATP 转化为 1nmol 果糖-1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。
计算公式：PFK (U/g 鲜重) = [△A×V反总÷(ε×d)×10⁹ ] ÷(W×V样÷V样总)÷T = 321×△A ÷W
(3)按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmol ATP 转化为 1nmol 果糖-1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。
计算公式：PFK (U/10⁴ cell) = [△A×V反总÷(ε×d)×10⁹ ] ÷(500×V样÷V样总)÷T = 0.64×△A
注： V反总：反应体系总体积，10^-³L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光径，1 cm；V样：加入样本体积，0.05mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，10min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万；10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol。

注意事项

1.比色皿中反应液的温度必须保持 37℃或 25℃，取小烧杯一只装入一定量的37℃或 25℃蒸馏水，将此烧杯放入 37℃或 25℃水浴锅中，在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中预热。
2.测定过程中CB0127UV-C、CB0127UV-D和样本在冰上放置，以免变性和酶失活。
3.不同匀浆组织中 PFK 活力不一样，做正式试验之前请做 1-2 次预试验，若 ΔA>0.5，则说明活力太高，必须用CB0127UV-ES稀释成适当浓度匀浆上清液（计算公式中乘以相应稀释倍数），或缩短反应时间至 2min 或 5min，使 ΔA<0.5，以提高检测灵敏度。
4.最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。
5.本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
6.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。