NCR Assay Kit (Microanalysis)

NCR催化NADPH还原氧化型细胞色素C，还原型细胞色素C在550nm处有特征吸收峰；通过测定550nm吸光度的增加速率，来计算NCR活性。

100T/96S规格的产品组成及保存条件： 

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

一、自备用品：
可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、普通离心机，超速离心机、可调式移液枪和蒸馏水。

二、粗酶液提取：
1.除去细胞核和线粒体等：称约0.5g组织，加入4℃预冷的1 mL CB0139M-A，冰上充分研磨，10 000g 4℃离心30min，取上清液，转移到超速离心管中。
2.粗制微粒体：4℃，100 000g，离心60min，弃上清液。
3.除血红蛋白等杂质：向步骤2的沉淀中加1 mL CB0139M-A，盖紧后充分震荡溶解，100 000g离心30min，弃上清液。
4.最终微粒体：向步骤3的沉淀中加CB0139M-B 0.5 mL，盖紧后充分震荡溶解，4℃保存待测。

三、测定步骤：
1.分光光度计/酶标仪预热30 min，调节波长到550 nm，蒸馏水调零。
2.CB0139M-B在37℃水浴中预热30min。
3.取微量石英比色皿/96孔板依次加入下列试剂：

四、NCR活性计算公式：
a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1.按蛋白浓度计算
活性单位定义：37℃中，每毫克蛋白每分钟催化产生1μmol还原型细胞色素C为1个酶活单位。
NCR (nmol/min /mg prot) = (△A测定管-△A空白管)÷(ε×d)×V反总÷(Cpr×V样)÷T = 550×(△A测定管-△A空白管)÷Cpr
2.按样本鲜重计算
活性单位定义：37℃中，每克组织每分钟催化产生1μmol还原型细胞色素C为1个酶活单位。
NCR (nmol/min/g 鲜重) = (△A测定管-△A空白管)÷(ε×d)×V反总÷(V样÷V样总×W)÷T= 275×(△A测定管-△A空白管)÷W
注：ε：还原型细胞色素C摩尔消光系数，19100L/mol/cm=0.0191L/μmol/cm；d：比色皿光径(cm)，1cm；V反总：反应体系总体积(L)，210μL=2.1×10^-4L；Cpr：上清液蛋白质浓度(mg/mL)，需要另外测定；V样：加入反应体系中上清液体积(mL)，10μL=0.01mL；V样总：提取液体积，0.5 mL；T：反应时间(min)，2min。

b. 用96孔板测定的计算公式如下
1.按照蛋白含量计算
活性单位定义：37℃中，每毫克蛋白每分钟催化产生1μmol还原型细胞色素C为1个酶活单位。
NCR (nmol/min/mg prot) = (△A测定管-△A空白管)÷(ε×d)×V反总÷(Cpr×V样)÷T= 1100×(△A测定管-△A空白管)÷Cpr
2.按照样本质量计算
活性单位定义：37℃中，每克组织每分钟催化产生1μmol还原型细胞色素c为1个酶活单位。
NCR (nmol/min/g 鲜重) = (△A测定管-△A空白管)÷(ε×d)×V反总÷(V样÷V样总×W)÷T= 550×(△A测定管-△A空白管)÷W
注： ε：还原型细胞色素C摩尔消光系数，19100L/mol/cm=0.0191L/μmol/cm；d：96孔板光径(cm)，0.5cm；V反总：反应体系总体积(L)，210μL=2.1×10^-4L；Cpr：上清液蛋白质浓度(mg/mL)，需要另外测定；V样：加入反应体系中上清液体积(mL)，10μL=0.01mL；V样总：提取液体积，0.5mL；T：反应时间(min)，2min。

1.蛋白定量测定，建议使用TargetMol生产的BCA Protein Quantification Kit (C0050)。
2.CB0139M-C、CB0139M-D临用前配制，配好未使用完的4℃可保存两天。
3.本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
4.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。