MCS Assay Kit (Microanalysis)

甲基柠檬酸合酶催化丙酰CoA和草酰乙酸产生甲基柠檬酰辅酶A，进一步水解产生甲基柠檬酸；该反应促使无色的DTNB转变成黄色的TNB，在 412nm处有特征吸光值。

100T/96S规格的产品组成及保存条件： 

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

一、自备用品：
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰、无水乙醇和蒸馏水。

二、样本的前处理：
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
1.称取约0.1g组织或收集500万细胞，加入1mL CB0240M-A和10μL CB0240M-C，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2.将匀浆600g，4℃离心5min。
3.弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。
4.上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的CS（此步可选做）。
5.在步骤4中的沉淀中加入200μL CB0240M-B和2μL CB0240M-C，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3秒，间隔10秒，重复30次），用于线粒体CS测定。

三、测定步骤：
1.分光光度计预热30min以上，调节波长至412nm，蒸馏水调零。
2.在CB0240M-E中加入1mL无水乙醇和22mL CB0240M-D，混匀，37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育5min；剩余试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
3.样本测定（在微量石英比色皿或96孔板中加入）：

四、MCS含量计算：

a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下：
1.按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。
MCS (nmol/min/mg prot) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr)÷T = 880×ΔA÷Cpr
2.按样本鲜重计算
单位的定义：每g组织每分钟催化产生1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。
MCS (nmol/min/g 鲜重) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W× V样÷V样总)÷T = 177.8×ΔA÷W
3.按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。
MCS (nmol/min/10⁴ cell) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V样÷V样总)÷T =0.3556×ΔA
注：V反总：反应体系总体积，2.4×10^-4 L；ε：TNB摩尔消光系数，1.36×10⁴ L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.01 mL；V样总：加入提取液体积，0.202 mL；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。

b.使用96孔板测定的计算公式如下：
1.按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。
MCS (nmol/min/mg prot) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr)÷T = 1760×ΔA÷Cpr
2.按样本鲜重计算
单位的定义：每g组织每分钟催化产生1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。
MCS (nmol/min/g 鲜重) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W× V样÷V样总)÷T = 355.6×ΔA÷W
3.按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。
MCS (nmol/min /10⁴ cell) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V样÷V样总)÷T = 0.711×ΔA
注：V反总：反应体系总体积，2.4×10^-4 L；ε：TNB摩尔消光系数，1.36×10⁴ L/mol/cm；d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.01 mL；V样总：加入提取液体积，0.202 mL；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万

1.蛋白定量测定，建议使用TargetMol生产的BCA Protein Quantification Kit (C0050)。
2.本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
3.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。