Hydroxyproline Assay Kit (Visible Spectrophotometry)

样品经酸水解产生游离的 HYP，进一步被氯胺 T 氧化，氧化产物与对二甲氨基苯甲醛反应，产生红色化合物，在 560nm 处有特征吸收峰，通过测定样品水解液 560nm 吸光值，可计算 HYP 含量。

50T/48S规格的产品组成及保存条件：

正式测定前务必取2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

一、自备用品：
可见分光光度计、1ml玻璃比色皿、水浴锅、天平、烘箱、玻璃管、离心机、可调式移液枪、研钵、6mol/L 盐酸和蒸馏水。

二、羟脯氨酸提取：
1.组织：称取约 0.2g 样本于玻璃管，将组织尽量剪碎以便消化，盖子稍松不密闭，加入 2mL 的提取液，煮沸或 110℃ 烘箱 2至6小时消化至没有可见大的团块，冷却后用 10mol/L NaOH（约 1mL）调节 pH 值至 6-8 范围内（不可过酸或过碱），再蒸馏水定容至 4mL；最后 16000rpm，25℃，离心 20min（若离心后仍有杂质，可通过过滤去除）， 取上清待测（过程中可能有黑色物质生成，若长时间不能消化，可能为碳化的物质，不影响实验）。
2.细胞：取 500 万个细胞，加入 1mL 的提取液，煮沸或 110℃烘箱 2 至 6 小时消化至透明状，冷却后用 10mol/L NaOH（约 0.5mL）调节 pH 值至 6-8 范围内（不可过酸或过碱），蒸馏水定容至 2mL，16000rpm，25℃，离心20min， 取上清待测。

三、测定步骤：
1.分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 560nm，蒸馏水调零。
2.将标准液用蒸馏水稀释为7.5、3.75、1.875、0.938、0.469、0.234、0.117µg/mL 的标准溶液。
3.在 EP 管中加入下列试剂：

四、羟脯氨酸含量计算：
1.标准曲线的绘制：以标准溶液的浓度为 x 轴，∆A标准(∆A标准=A标准管-A空白管)为 y 轴，绘制标准曲线，得到方程 y=kx+b，再将∆A测定(∆A测定=A测定管-A空白管)带入方程得到 x(µg/mL)。
2.羟脯氨酸含量的测定：
(1)按样本质量计算：
组织羟脯氨酸含量(µg/g 质量)= x×V样本÷(W×V样本÷V 组提)=4x÷W
(2)按样本蛋白浓度计算：
组织羟脯氨酸含量(µg/mg prot)= x×V样本÷(Cpr×V样本)=x÷Cpr
(3)按细菌或细胞数量计算：
细胞羟脯氨酸含量(µg/10⁴ cell)= x×V样本÷(细胞数量×V样本÷V 胞提)=2x÷细胞数量
V样本：加入的样本体积，0.2mL；V 组提：组织提取液体积，4mL；V 胞提：细胞提取液体积， 2ml；W： 样本质量，g；细胞数量：以10⁴为单位，万个；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL。

1.试剂有一定的毒性，请操作时做好防护措施，防止吸入或与皮肤接触。
2.如果测定吸光值超过线性范围吸光值，可以增加样本量或者稀释样本后再进行测定。
3.按样本蛋白浓度计算时，需单独提取样本中的蛋白质并测定。
4.本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
5.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。