Hexokinase Assay Kit (Microanalysis)

HK 催化葡萄糖合成 6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖脱氢酶进一步催化 6-磷酸葡萄糖脱氢生成NADPH，NADPH 在 340nm 有特征吸收峰。

100T/96S规格的产品组成及保存条件：

正式测定前务必取2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

一、自备用品：
紫外分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、研钵、冰和蒸馏水。

二、样本预处理：
1.细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴ 个）：CB0088M-ES体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL CB0088M-ES），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）； 8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2.组织：按照组织质量（g）：CB0088M-ES体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL CB0088M-ES），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
3.血清（浆）样品：直接检测。

三、测定步骤：
1.分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。
2.试剂与配制：
（1）在CB0088M-B中加入 18mL CB0088M-A充分溶解，置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种） 水浴 5min；现配现用；
（2）在CB0088M-C中加入 1mL CB0088M-A，充分溶解待用；用不完的试剂 4℃保存一周；
3.在微量石英玻璃比色皿或96孔板中加入下列试剂：

四、计算公式：
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1.血清(浆)HK 活性
单位的定义：每毫升血清(浆)在每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。
HK (U/mL) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷V样÷T=643×ΔA
2.组织、细菌或细胞中 HK 活性
1.按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。
HK (U/mg prot) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr)÷T=643×ΔA÷Cpr
2.按样本鲜重计算
单位的定义：每 g 组织每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。
HK (U/g 鲜重) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W×V样÷V样总)÷T=643×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。
HK (U/10⁴ cell) =[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V样÷V样总)÷T=1.286×ΔA
注： V反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.01 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。
b. 用 96 孔板测定的计算公式如下
1.血清(浆)HK 活性
单位的定义：每毫升血清(浆)在每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。
HK (U/mL) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷V样÷T=1286×ΔA
2.组织、细菌或细胞中 HK 活性
1.按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。
HK (U/mg prot) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr)÷T=1286×ΔA÷Cpr
2.按样本鲜重计算
单位的定义：每 g 组织每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。
HK (U/g 鲜重) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W×V样÷V样总)÷T=1286×ΔA÷W
3.按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。
HK (U/10⁴ cell) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V样÷V样总)÷T=2.572×ΔA
注： V反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：96 孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.01 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。

1.不同匀浆组织中 HK 活力不一样，做正式试验之前请做 1-2 只预试，若 ΔA>0.5，则说明组织活力太高，必须用提取液稀释成适当浓度匀浆上清液（计算公式中乘以相应稀释倍数），或缩短反应时间至 2min,使 ΔA<0.5，以提高检测灵敏度。
2.最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。
3.本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
4.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。