Hexokinase Assay Kit (Spectrophotometry)

HK 催化葡萄糖合成 6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖脱氢酶进一步催化 6-磷酸葡萄糖脱氢生成NADPH，NADPH 在 340nm 有特征吸收峰。

50T/48S规格的产品组成及保存条件：

正式测定前务必取2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

一、自备用品：
紫外分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

二、试剂预配制：
CB0088UV-B：临用前加入 30mL 蒸馏水充分溶解备用；用不完的试剂 4℃ 保存一周；
CB0088UV-D：临用前加入 4mL 蒸馏水充分溶解备用；用不完的试剂 4℃ 保存一周；
CB0088UV-E：临用前加入 2mL 蒸馏水充分溶解备用；现配现用；
CB0088UV-F：临用前加入 250μL CB0088UV-A和 250μL蒸馏水充分溶解备用； 用不完的试剂 4℃保存一周；
样本预处理：
1.细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴ 个）：CB0088UV-ES体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL CB0088UV-ES），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）； 8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2.组织：按照组织质量（g）：CB0088UV-ES体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL CB0088UV-ES），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
3.血清（浆）样品：直接检测。

三、测定步骤：
1.分光光度计预热 30min，调节波长到340 nm，蒸馏水调零。
2.CB0088UV-A、B、C、D、E分别置于 25℃（一般物种）或者 37℃（哺乳动物）水浴中预热10min。
3.按下表加入下列试剂：

四、计算公式：
1.血清(浆)HK 活性
单位的定义：每毫升血清(浆)在每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。
HK (U/mL) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷V样÷T = 1113×ΔA
2.组织、细菌或细胞中 HK 活性
(1)按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。
HK (U/mg prot) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr)÷T = 1113×ΔA÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
单位的定义：每 g 组织每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。
HK (U/g 鲜重) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W ×V样÷V样总)÷T = 1113×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。
HK (U/10⁴ cell) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V样÷V样总) ÷T =2.226×ΔA
注： V反总：反应体系总体积，1.038×10^-3 L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.03 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。

1.如果一次性测定样本数较多，可将试剂A、B、C、D、E、F按比例配成混合液，预热 10min。
2.不同匀浆组织中 HK 活力不一样，做正式试验之前请做 1-2 只预试，若 ΔA>0.5，则说明组织活力太高，必须用提取液稀释成适当浓度匀浆上清液（计算公式中乘以相应稀释倍数），或缩短反应时间至 2min,使 ΔA<0.5，以提高检测灵敏度。
3.比色皿中反应液的温度必须保持 37℃或 25℃，取小烧杯一只装入一定量的 37℃或 25℃蒸馏水，将此烧杯放入 37℃或 25℃水浴锅中，在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中；且最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。
4.本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
5.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。