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常见问题解答
GAPDH Assay Kit (UV Spectrophotometry)
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产品编号 CB0109UV
别名 3-磷酸甘油醛脱氢酶活性检测试剂盒（紫外分光光度法）
3-磷酸甘油醛脱氢酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）催化3-磷酸甘油醛氧化生成1,3-二磷酸甘油酸，是糖酵解途径的关键酶，与糖异生途径、体内血糖浓度的维持和糖尿病的发生密切相关，在机体糖、脂、蛋白代谢紊乱疾病中发挥重要作用。
| 规格 | 价格 | 库存 | 数量 |
|---|---|---|---|
| 50 T | ¥ 5,880 | 10-12日内发货 |
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TargetMol 的所有产品仅用作科学研究或药证申报，不能被用于人体，我们不向个人提供产品和服务。请您遵守承诺用途，不得违反法律法规规定用于任何其他用途。
检测原理
3-磷酸甘油酸激酶催化三磷酸甘油酸和ATP生成1,3二磷酸甘油酸。GAPDH逆向催化1,3二磷酸甘油酸和NADH生成3磷酸甘油醛、无机磷和NAD，340nm处测定NADH的减少量可反映GADPH活性的高低。
产品规格
50T/48S规格的产品组成及保存条件：
| 编号 | 规格 | 储存条件 |
|---|---|---|
| CB0109UV-ES-1 | 50mL×1瓶 | 4℃保存； |
| CB0109UV-ES-2 | 50mL×1瓶 | 4℃保存； |
| CB0109UV-A | 粉剂×1瓶 | -20℃保存； |
| CB0109UV-B | 50mL×1瓶 | 4℃保存； |
| CB0109UV-C | 28μL×1支 | 4℃保存； |
正式测定前务必取2-3 个预期差异较大的样本做预测定。
操作说明
一、自备用品：
紫外分光光度计、1 mL石英比色皿、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。
二、样本的前处理：
1.总GAPDH酶提取：建议称取约0.1g样本，加入1mL CB0109UV-ES-1，冰浴匀浆后超声破碎（冰浴，200W，破碎3s，间歇7s，总时间1min），然后4℃，8000g离心10min，取上清测定。
2.胞浆和叶绿体GAPDH酶的分离：按照植物组织质量（g）：提取液体积（mL）为1：5～10的比例（建议称取约0.1g样本，加入1mL CB0109UV-ES-1），冰浴匀浆后于4℃，200g离心5min，弃沉淀，取上清在4℃，8000g离心10min，取上清用于测定胞浆GAPDH酶活性，取沉淀加1mL CB0109UV-ES-2，震荡溶解后超声破碎（冰浴，200W，破碎3s，间歇7s，总时间1min），然后4℃，8000g离心10min，取上清测定叶绿体中GAPDH酶活性。
3.建议测定总GAPDH酶活性，按照步骤1提取粗酶液，若需要分别测定胞浆和叶绿体中的GAPDH，则按照步骤2提取粗酶液。
4.细菌或培养细胞的前处理：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：CB0109UV-ES-1体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL CB0109UV-ES-1），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
三、测定步骤：
1.分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
2.试剂配制：
（1）工作液的配制：将CB0109UV-B全部倒入CB0109UV-A瓶中，充分溶解，置37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）预热10分钟；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
（2）在CB0109UV-C中加入500μL蒸馏水，充分混匀待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
3.样本测定（在1mL石英比色皿中加入下列试剂）：
| 试剂名称 | 测定管 （µL） |
|---|---|
| 样本 | 30 |
| CB0109UV-C | 20 |
| 工作液 | 950 |
| 立即混匀，加入最后一个试剂的同时开始计时，记录340nm处20s时的吸光值A1和 5min20s后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。 | |
四、GAPDH活性计算：
1.按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
GAPDH (nmol/min/mg prot) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr)÷T = 1072×ΔA÷Cpr
2.按样本鲜重计算
单位的定义：每g组织每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
GAPDH (nmol/min/g 鲜重) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V样÷V样总)÷T = 1072×ΔA÷W
3.按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每一万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
GAPDH (nmol/min/104 cell) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500 ×V样÷V样总)÷T =2.144×ΔA
注：V反总：反应体系总体积，1×10-3 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.03 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。
注意事项
1.本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
2.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
引用文献
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