GAPDH Assay Kit (Microanalysis)

3-磷酸甘油酸激酶催化三磷酸甘油酸和ATP生成1,3二磷酸甘油酸。GAPDH逆向催化1,3二磷酸甘油酸和NADH生成3磷酸甘油醛、无机磷和NAD，340nm处测定NADH的减少量可反映GADPH活性的高低。

100T/96S规格的产品组成及保存条件：

正式测定前务必取2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

一、自备用品：
紫外分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

二、样本的前处理：
1.总GAPDH酶提取：建议称取约0.1g样本，加入1mL CB0109M-ES-1，冰浴匀浆后超声破碎（冰浴，200W，破碎3s，间歇7s，总时间1min），然后4℃，8000g离心10min，取上清测定。
2.胞浆和叶绿体GAPDH酶的分离：按照植物组织质量（g）：提取液体积（mL）为1：5～10的比例（建议称取约0.1g样本，加入1mL CB0109M-ES-1），冰浴匀浆后于4℃，200g离心5min，弃沉淀，取上清在4℃，8000g离心10min，取上清用于测定胞浆GAPDH酶活性，取沉淀加1mL CB0109M-ES-2，震荡溶解后超声破碎（冰浴，200W，破碎3s，间歇7s，总时间1min），然后4℃，8000g离心10min，取上清测定叶绿体中GAPDH酶活性。
3.建议测定总GAPDH酶活性，按照步骤1提取粗酶液，若需要分别测定胞浆和叶绿体中的GAPDH，则按照步骤2提取粗酶液。
4.细菌或培养细胞的前处理：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：CB0109M-ES-1体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL CB0109M-ES-1），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

三、测定步骤：
1.分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
2.试剂配制：
（1）工作液的配制：将CB0109M-B全部倒入CB0301UV-A瓶中，充分溶解，置37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）预热10分钟；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
（2）在CB0109M-C中加入500μL蒸馏水，充分混匀待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
3.样本测定（在微量石英比色皿或96孔板中加入下列试剂）：

四、GAPDH活性计算：
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1.按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
GAPDH (nmol/min/mg prot) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr)÷T = 1286×ΔA÷Cpr
2.按样本鲜重计算
单位的定义：每g组织每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
GAPDH (nmol/min/g 鲜重) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W ×V样÷V样总)÷T = 1286×ΔA÷W
3.按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每一万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
GAPDH (nmol/min/10⁴ cell) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500 ×V样÷V样总)÷T =2.572×ΔA
注：V反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.005 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。

b. 用96孔板测定的计算公式如下
1.按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
GAPDH (nmol/min/mg prot) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr)÷T = 2572×ΔA÷Cpr
2.按样本鲜重计算
单位的定义：每g组织每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
GAPDH (nmol/min/g 鲜重) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W ×V样÷V样总)÷T = 2572×ΔA÷W
3.按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每一万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
GAPDH (nmol/min/10⁴ cell) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500 ×V样÷V样总)÷T =5.144×ΔA
注：V反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.005 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。

1.本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
2.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。