DHA Assay Kit (Microanalysis)

在细胞呼吸过程中，氢受体2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-Triphenyl Tetrazolium Chloride, TTC）在脱氢酶作用下接受氢以后，被还原为三苯基甲鐟（Triphenyl Formazone, TF），TF呈现红色，于485nm测定其吸光值，即得脱氢酶活性。

100T/96S规格的产品组成如下：

注：正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

一、自备用品：
可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、筛子、天平、恒温培养箱或水浴锅、低温离心机、冰、蒸馏水、甲醇（不允许快递，请用户自备）。
二、粗酶液提取：

1. 细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL CB0067M-ES），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。
2. 组织：按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL CB0067M-ES）进行冰浴匀浆，然后8000g，4℃，离心20min。
3. 液体：直接检测。

三、测定步骤：

1. 分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长至485nm。
2. 样本测定：在微量石英比色皿/96孔板中加入下列试剂：

注：空白管只需测定一次。
四、脱氢酶活力计算公式：
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

标准曲线：y = 0.0422x - 0.0312；R² = 0.9988；x为标准品浓度（μg/mL），y为吸光值。

1. 按照蛋白浓度计算

酶活单位定义：在37℃时，每mg蛋白样品每min催化产生1μgTF为一个酶活性单位。
DHA (μg/ min / mg prot) = (△A+0.0312)÷0.0422×V 反总÷(Cpr×V 样)÷T = 0.181×(△A+0.0312)÷Cpr
2. 按样本质量计算

酶活单位定义：在37℃时，每克样品每min催化产生1μgTF为一个酶活性单位。
DHA (μg/ min/g 鲜重) = (△A+0.0312)÷0.0422×V 反总÷(W×V 样÷V 样总)÷T = 0.181×(△A+0.0312)÷W
3. 按液体体积计算

酶活单位定义：在37℃时，每mL样本每min催化产生1μgTF为一个酶活性单位。
DHA (μg/min/mL) = (△A+0.0312)÷ 0.0422×V 反总÷V 样÷T = 0.181×(△A+0.0312)
注：V 反总：反应总体积，1.1mL；V 样：加入反应体系中样本体积，0.1mL；T：培养时间，1d=1440min；W：样品质量，g；Cpr：蛋白浓度，mg/mL。
b. 用96孔板测定的计算公式如下

标准曲线：y = 0.0211x - 0.0312；R² = 0.9988；x为标准品浓度（μg/mL），y为吸光值。

1. 按蛋白含量计算

酶活单位定义：在37℃时，每mg蛋白样品每min催化产生1μgTF为一个酶活性单位。
DAO活性(nmol/min/mg prot) = ΔA÷(ε×d)×V 反总÷(V 样×Cpr)÷T = 228×ΔA÷Cpr
2. 按样本质量计算

酶活定义：37℃，pH7.6时，每克样品1min内转化1nmol底物的酶量为一个酶活单位。
DHA (μg/min/mg prot) = (△A+0.0312)÷0.0211×V 反总÷(Cpr×V 样)÷T = 0.362×(△A+0.0312)÷Cpr
3. 按液体体积计算

酶活单位定义：在37℃时，每mL样本每min催化产生1μgTF为一个酶活性单位。
DHA (μg/min/mL) = (△A+0.0312)÷0.0211×V 反总÷V 样÷T = 0.362×(△A+0.0312)
注：V 反总：反应总体积，1.1mL；V 样：加入反应体系中样本体积，0.1mL；T：培养时间，1d=1440min；W：样品质量，g；Cpr：蛋白浓度，mg/mL。

1. 配制好的试剂避光保存于4℃，最好在一周内使用，若出现红色，则不能使用。
2. 蛋白定量测定，建议使用TargetMol生产的BCA Protein Quantification Kit (C0050)。
3. 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
4. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。