CYB5 Assay Kit (Microanalysis)

氧化型细胞色素b5经连二亚硫酸钠还原后，在424nm处有最大吸收峰，通过测定424nm和490nm处吸光值的差异，即可计算出细胞色素b5的含量。

100T/96S规格的产品组成如下：

注：正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

一、自备用品：
可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、普通离心机，超速离心机、可调式移液枪和蒸馏水。
二、样品中细胞色素b5提取：

1. 除去细胞核和线粒体等大分子物质：称约0.5g组织，加入1mL 4℃预冷的CB0062M-A，冰上充分研磨，10 000g 4℃离心30min，取上清液转入超速离心管。
2. 粗制微粒体：4℃，100 000g，离心60min，弃上清液。
3. 除血红蛋白等杂质：向步骤2的沉淀中加1mL CB0062M-A，盖紧后充分震荡溶解，100 000g离心30min，弃上清液。
4. 最终微粒体：向步骤3的沉淀中加CB0062M-B 0.5mL，盖紧后充分震荡溶解，即待测液，该待测液需当天测定。
5. 该待测液需当天使用。

三、测定步骤：

1. 分光光度计/酶标仪预热30 min。
2. 工作液置于25℃水浴中预热30 min。
3. 取微量玻璃比色皿/96孔板依次加入下列试剂：

注：只需要做一个空白管。
四、CYB5活性计算公式：
b. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1. 按蛋白浓度计算

CYB5含量(nmol/mg prot) = (△A 测定管-△A 空白管)÷(ε×d)×V 反总÷(Cpr×V 样) = 122.8×(△A 测定管-△A 空白管)÷Cpr
2. 按样本鲜重计算

CYB5含量 (nmol/g 鲜重) = (△A 测定管-△A 空白管)÷(ε×d)×V 反总×(V 样总÷V 样)÷W
= 61.4×(△A 测定管-△A 空白管)÷W
注：ε：还原型细胞色素b5纳摩尔消光系数，171×10^-6 L/nmol/cm；d：比色皿光径（cm），1cm；V 反总：反应体系总体积，210 μL = 2.1×10^-4 L；Cpr：待测液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定；V 样：加入反应体系中待测液体积，10 μL=0.01 mL；V 样总：待测液总体积，0.5 mL；W：样品质量（g）。
b. 使用96孔板测定的计算公式如下

1. 按蛋白浓度计算

CYB5含量 (nmol/mg prot) = (△A 测定管-△A 空白管)÷(ε×d)×V 反总÷(Cpr×V 样)
= 245.6×(△A 测定管-△A 空白管)÷Cpr
2. 按样本质量计算

CYB5含量 (nmol/g 鲜重) = (△A 测定管-△A 空白管)÷(ε×d)×V 反总×(V 样总÷V 样)÷W
= 122.8×(△A 测定管-△A 空白管)÷W
注：ε：还原型细胞色素b5纳摩尔消光系数，171×10^-6 L/nmol/cm；d：96孔板光径（cm），0.5cm；V 反总：反应体系总体积，210μL = 2.1×10^-4 L；Cpr：待测液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定；V 样：加入反应体系中待测液体积，10μL = 0.01mL；V 样总：待测液总体积，0.5 mL；W：样品质量（g）。

1. 蛋白定量测定，建议使用TargetMol生产的BCA Protein Quantification Kit (C0050)。
2. 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
3. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。