Citrate Synthase Assay Kit (Spectrophotometry)

CS 催化乙酰 CoA 和草酰乙酸产生柠檬酰辅酶 A，进一步水解产生柠檬酸；该反应促使无色的 DTNB 转变成黄色的 TNB，在 412nm 处有特征吸光值，吸光值的变化与酶活性成正比。

50T/24S规格的产品组成如下：

注：正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

一、自备用品：
可见分光光度计、1mL玻璃比色皿、低温离心机、水浴锅、可调式移液枪和蒸馏水。
二、样本的前处理：
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

1. 称取约 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1mL CB0053S-A和 10μL CB0053S-C，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2. 将匀浆 600g，4℃离心 5min。
3. 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。
4. 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的 CS（此步可选做）。
5. 在步骤 4 中的沉淀中加入 200μL CB0053S-B和 2μL CB0053S-C，超声波破碎（冰浴，功率 20％ 或 200W，超声 3 秒，间隔 10 秒，重复 30 次），用于线粒体 CS 测定。

三、测定步骤：

1. 分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 412nm，蒸馏水调零。
2. 将CB0053S-D, E, F, G在 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）孵育 5min。
3. 在1mL 玻璃比色皿中加入：

四、CS 酶活性计算公式：
a. 组织中 CS 活力的计算：

1. 按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。
CS上清（U/mg prot）=ΔA上清÷ε÷d×V 反总÷（Cpr 上清×V 样本）÷T
=1050×ΔA 上清÷Cpr 上清
CS沉淀（U/mg prot）=ΔA沉淀÷ε÷d×V 反总÷（Cpr 沉淀×V 样本）÷T
=1050×ΔA 沉淀÷Cpr 沉淀
CS（U/mg prot）=CS 上清+CS 沉淀=1050×ΔA 上清÷Cpr 上清+1050×ΔA 沉淀÷Cpr 沉淀
2. 按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g 组织每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。
CS 上清（U/g 鲜重）=ΔA 上清÷ε÷d×V 反总÷（W×V 样本÷V 提取）÷T =1050×ΔA 上清÷W
CS 沉淀（U/g 鲜重）=ΔA 沉淀÷ε÷d×V 反总÷（W×V 样本÷V 沉淀）÷T =212×ΔA 沉淀÷W
CS（U/g 鲜重）=CS 上清+CS 沉淀=1050×ΔA 上清÷W+212×ΔA 沉淀÷W
b. 细菌或培养细胞中CS 活力的计算：

按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。
CS 上清（U/10⁴ cell）=ΔA 上清÷ε÷d×V 反总÷（500×V 样本÷V 提取）÷T=2.1×ΔA 上清
CS 沉淀（U/10⁴ cell）=ΔA 沉淀÷ε÷d×V 反总÷（500×V 样本÷V 沉淀）÷T =0.4242×ΔA 沉淀
CS（U/10⁴ cell）=CS 上清+CS 沉淀=2.1×ΔA 上清+0.4242×ΔA 沉淀

1. 注： ε：TNB 的消光系数，13.6×10^-3mL/(nmol·cm)；V 反总：反应体系总体积，1mL；d：比色皿光径，1cm；V 样本：加入的样本体积，0.035mL；V 提取：提取液体积，1mL；V 沉淀：溶解沉淀的总体积，0.202mL；T：反应时间，2min；Cpr 上清：上清液的蛋白浓度，mg/mL；Cpr 沉淀：沉淀溶解后的蛋白浓度, mg/mL；W：样本鲜重，g。

1. 测定过程中样本和所有试剂在冰上放置，以免变性和失活。
2. 比色皿中反应液的温度必须保持 37℃或 25℃，取小烧杯一只装入一定量的37℃或25℃蒸馏，将此烧杯放入 37℃或 25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。
3. 最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。
4. 蛋白定量测定，建议使用TargetMol生产的BCA Protein Quantification Kit (C0050)。
5. 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
6. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。