CS 催化乙酰 CoA 和草酰乙酸产生柠檬酰辅酶 A，进一步水解产生柠檬酸；该反应促使无色的 DTNB 转变成黄色的 TNB，在 412nm 处有特征吸光值，吸光值的变化与酶活性成正比。

100T/48S规格的产品组成及保存条件：

正式测定前务必取2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

一、自备用品：
恒温水浴锅、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板和蒸馏水、低温离心机、水浴锅、可调节移液器。

二、样本的前处理：
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
1.称取约 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1mL CB0053M-A和 10μL CB0053M-C，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2.将匀浆 600g，4℃离心 5min。
3.弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。
4.上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的 CS（此步可选做）。
5.在步骤④中的沉淀中加入 200μL CB0053M-B和 2μL CB0053M-C，超声波破碎（冰浴，功率 20％ 或 200W，超声 3 秒，间隔 10 秒，重复 30 次），用于线粒体 CS 测定。
6.柠檬酸合酶酶活即沉淀和上清液中的酶活之和。

三、测定步骤：
1.分光光度计/酶标仪预热 30min，调节波长到412nm，蒸馏水调零。
2.将CB0053M-D、CB0053M-E、CB0053M-F、CB0053M-G 在 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）孵育 5 min
3.在微量石英比色皿/96 孔板中依次加入：

四、CS 酶活性计算公式：
a. 按微量玻璃比色皿计算:
1.按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。
CS 上清(U/mg prot)=∆A上清÷(ε×d)×V反总÷(Cpr 上清×V样本)÷T =1050×∆A 上清÷Cpr 上清
CS 沉淀(U/mg prot)=∆A 沉淀÷(ε×d)×V反总÷(Cpr 沉淀×V样本)÷T =1050×∆A 沉淀÷Cpr 沉淀
CS(U/mg prot)=CS 上清+CS 沉淀=1050×∆A 上清÷Cpr 上清+1050×∆A 沉淀÷Cpr 沉淀

2.按样本鲜重计算：
单位的定义：每 g 组织每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。
CS 上清(U/g 鲜重)=∆A 上清÷(ε×d)×V反总÷(W×V样本÷V提取)÷T =1061×∆A 上清÷W CS 沉淀(U/g 鲜重)=∆A 沉淀÷(ε×d)×V反总÷(W×V样本÷V 沉淀)÷T =212×∆A 沉淀÷W CS(U/g 鲜重)=CS 上清+CS 沉淀=1061×∆A 上清÷W+212×∆A 上清÷W。
3.按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。
CS 上清(U/10⁴ cell)=∆A 上清÷(ε×d)×V反总÷(500×V样本÷V提取)÷T=2.1×∆A 上清
CS 沉淀(U/10⁴ cell)=∆A 沉淀÷(ε×d)×V反总÷(500×V样本÷V 沉淀)÷T =0.42×∆A 沉淀
CS(U/10⁴ cell)=CS 上清+CS 沉淀=2.1×∆A 上清+0.42×∆A 沉淀。
注：ε：TNB 的消光系数，13.6×10^-3mL/(nmol·cm)；V反总：反应体系总体积，0.2 mL；d：比色皿 光径，1cm；V样本：加入的样本体积，0.007mL；V提取：提取液体积，1.01mL；V 沉淀：溶解沉 淀的总体积，0.202mL；T：反应时间，2min；Cpr 上清：上清液的蛋白浓度，mg/mL；Cpr 沉淀： 第 3 页 共 4 页 沉淀溶解后的蛋白浓度, mg/mL；W：样本鲜重，g；500：细胞数量/细菌，500 万。

b. 按96孔板计算:
将上述公式中的 d=1cm 改为 d=0.6cm(96 孔板光径)进行计算即可。

1.蛋白定量测定，建议使用TargetMol生产的BCA Protein Quantification Kit (C0050)。
2.本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
3.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。