Name: AH Assay Kit (Spectrophotometry)
Brand: TargetMol
SKU: CB0016S
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AH Assay Kit (Spectrophotometry)

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产品编号 CB0016S

别名 苯胺-4-羟化酶活性检测试剂盒（分光光度法）

细胞色素P450酶是一组主要存在于肝脏的同工酶，在外源物质代谢中具有重要作用，尤其是药物和毒物的代谢。苯胺-4-羟化酶（Aniline-4-hydroxylase, AH）在P450酶系中相当于CYP2E1亚型，CYP2E1不仅参与了药物的代谢，而且还能催化多种前致癌物和前毒物的活化过程。

规格	价格	库存	数量
50 T	¥ 968	待询

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实验操作小课堂

常见问题解答

检测原理

AH催化苯胺羟化后产生的4-氨基酚，进一步转变为酚-吲哚复合物，在630nm处有特征吸收峰；通过测定630nm吸光度增加速率，来计算AH活性。

产品组成

50T/24S规格的产品组成如下：

组成	规格	储存条件
CB0016S-A	粉剂×1瓶	4℃保存；临用前加50mL蒸馏水充分溶解。
CB0016S-B	液体×1瓶	4℃保存。
CB0016S-C	粉剂×1瓶	4℃保存；临用前加入26mL蒸馏水，充分溶解。
CB0016S-D	粉剂×1瓶	4℃保存；临用前加入13mL蒸馏水，充分溶解。
CB0016S-E	液体×1瓶	4℃保存。
CB0016S-F	粉剂×1瓶	（腐蚀性试剂），4℃避光保存；临用前加入26mL蒸馏水，充分溶解。
CB0016S-G	粉剂×1瓶	4℃保存；临用前加入26mL蒸馏水充分溶解。
CB0016S-S	液体×1瓶	标准液10μmol/L，4℃避光保存。

注：正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

操作说明

一、自备用品：
可见分光光度计、1mL玻璃比色皿、普通离心机、超速离心机、可调式移液枪、双蒸水和冰。
二、粗酶液提取：
1.除去细胞核和线粒体等大分子物质：称约0.5g组织，加入1 mL 4℃预冷的CB0016S-A，冰上充分研磨，10 000g 4℃离心30min，取上清液转入超速离心管。
2.粗制微粒体：4℃，100 000g，离心60min，弃上清液。
3.除血红蛋白等杂质：向步骤2的沉淀中加1 mL CB0016S-A，盖紧后充分震荡溶解，100 000g离心30min，弃上清液。
4.最终微粒体：向步骤3的沉淀中加CB0016S-B 0.5 mL，盖紧后充分震荡溶解，4℃保存待测。
5.该待测液需当天使用。
三、测定步骤：
1.分光光度计预热30 min，调节波长到630 nm，蒸馏水调零。
2.CB0016S-C在37℃水浴中预热30min。
3.CB0016S-E置于冰浴预冷30min。
4.取1.5 mL EP管依次加入下列试剂：

试剂名称	对照管 (μL)	测定管 (μL)	标准管 (μL)
粗酶液	250	250
CB0016S-C	500	500
蒸馏水	250	250
混匀后37℃水浴中保温30min；再加入。
CB0016S-E	500	500
混匀后冰浴5min，11000rpm，4℃，离心10min；取上清液加入新的1.5 mL EP管。
上清液	500	500
标准品			500
CB0016S-F	500	500	500
CB0016S-G	500	500	500
混匀后室温静置30min，于630 nm测定光吸收，分别标记为A对照管、A测定管、A标准管。

注：每个样品都需要做对照管。

四、AH活性计算公式：
1.按蛋白浓度计算
活性单位定义：37℃中每毫克蛋白每分钟催化产生1nmol 4-氨基酚为1个酶活单位。
AH活性 (nmol/min/mg prot)
= C标准品×V标准品×(A测定管-A对照管)÷A标准管×稀释倍数÷(Cpr×V样)÷T
= 2×(A测定管-A对照管)÷A标准管÷Cpr。
2.按样本鲜重计算
活性单位定义：37℃中每克样本每分钟催化产生1nmol 4-氨基酚为1个酶活单位。
AH活性 (nmol/min/g 鲜重)
= C标准品×V标准品×(A测定管-A对照管)÷A标准管×稀释倍数÷(W×V样)÷T
= 2×(A测定管-A对照管)÷A标准管÷W
注：C标准品：10μmol/L；V标准品：500μL=0.0005L；稀释倍数：V反总÷V上清液=1500μL÷500μL=3；Cpr：粗酶液蛋白质浓度，mg/mL，需要另外测定，建议使用TargetMol公司BCA蛋白质含量测定试剂盒 (C0050)；V样：加入反应体系中粗酶液体积，250μL=0.25 mL；W：样本质量，g；T：反应时间，30min。