TPS Assay Kit (Microanalysis)

Name: TPS Assay Kit (Microanalysis)
Brand: TargetMol
SKU: CB0238M
Rating: 5 (4 reviews)

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产品编号 CB0238M

别名 海藻糖-6-磷酸合成酶活性检测（微量法）

海藻糖是由两个葡萄糖分子以α,α-1-1 糖苷键连接而成的一种非还原双糖，广泛存在于细菌、酵母菌、霉菌、食用菌、低等植物、昆虫、无脊椎动物和高等植物等多种有机体中。海藻糖的非还原性决定了它对酸、碱、高温等的稳定性。另外，它本身具有很强的吸水性，使它在生物体内具有抗脱水作用，在逆境条件下可通过识别外界刺激、产生和传递信号、基因表达和代谢调节来保护植物免受不良环境的伤害。植物体内主要以葡萄糖为底物合成海藻糖，该反应首先在海藻糖-6-磷酸合成酶（trehalose-6-phosphate synthase，TPS）的作用下，催化尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）和 6-磷酸葡萄糖反应生成中间产物6-磷酸海藻糖，再在海藻糖-6-磷酸磷酸酶（trehalose 6-phosphate phosphatase，TPP）的作用下去磷酸化，生成海藻糖。因此，测定TPS活性对于研究植物逆境具有重要意义。

规格	价格	库存	数量
100 T	¥ 3,024	4-6日内发货

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实验操作小课堂

常见问题解答

检测原理

海藻糖-6-磷酸合成酶（trehalose-6-phosphate synthase，TPS）催化UDPG与G6P生成海藻糖-6-磷酸，同时产生UDP；UDP在丙酮酸激酶与乳酸脱氢酶作用下，氧化NADH为NAD⁺，NADH的下降速率与UDP含量成正比，通过340nm吸光度下降速率反映TPS活性。

产品规格

100T/96S规格的产品组成及保存条件：

编号	规格	储存条件
CB0238M-ES	100mL×1瓶	4℃保存；
CB0238M-A	粉剂×1瓶	-20℃保存；临用前加入12mL CB0238M-E溶解，剩余试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
CB0238M-B	粉剂×2瓶	-20℃保存；临用前每瓶加入10mL CB0238M-E溶解；现配现用；
CB0238M-C	粉剂×1瓶	-20℃避光保存；临用前加入0.1mL CB0238M-E溶解，剩余试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
CB0238M-D	100μL×1瓶	4℃避光保存；临用前低速离心，以防止试剂沾在管壁；
CB0238M-E	50mL×1瓶	4℃保存；
工作液配制：临用前，先配置好CB0238M-B和CB0238UV-C，然后在CB0238M-B瓶中加入10μLCB0238UV-C和10μL CB0238M-D，充分混匀，现配现用。

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

操作说明

一、自备用品：
酶标仪、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

二、样品处理：
1.细菌或细胞的处理：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴ 个）：CB0238M-ES体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL CB0238M-ES），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3S，间隔 10S，重复30 次）；8000g，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2.组织的处理：按照组织质量（g）：CB0238M-ES体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g组织，加入 1mL CB0238M-ES），冰浴中匀浆。8000g ，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

三、测定步骤：
1.分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
2.工作液配制：详见试剂的组成和工作液的配制。
3.在EP管中依次加入下列试剂：

试剂名称	测定管（μL）
样本	100
CB0238M-A	100
混匀，30℃反应20min，95℃水浴2min灭活，冷却至室温。10000g 4℃离心5min，取上层反应液待测。
在微量石英比色皿/96孔板中加入如下试剂反应液
反应液	20
工作液	180
混匀，测定340nm下5min后吸光值A1与10min后吸光值A2，ΔA=A1-A2。

四、TPS酶活性计算公式：
1.按照蛋白浓度计算
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化1nmol NADH定义为一个酶活力单位。
TPS活力 (U/mg prot) = ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹÷(V样×Cpr)÷T×10 = 1286×ΔA÷Cpr
2.按样本鲜重计算
单位的定义：每g组织每分钟催化1nmol NADH定义为一个酶活力单位。
TPS活力 (U/g 鲜重) = ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹÷(W× V样÷V样总)÷T×10 = 1286×ΔA÷W
3.按细菌或细胞密度计算
每1万个细菌或细胞每分钟催化1nmol NADH定义为一个酶活力单位。
TPS活力 (U/10⁴ cell) = ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹÷(V样×细胞数量)÷T×10 =2.57×ΔA
注：V反总：反应体系总体积，0.2mL；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.1 mL；V样总：加入CB0238M-ES体积，1 mL；T：反应时间，5 min；10，稀释倍数；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量；细胞数量，500万。