Reduced Glutathione Assay Kit (Microanalysis)

100T/96S规格的产品组成及保存条件：

正式测定前务必取2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

一、自备用品：
低温离心机、匀浆器/研钵、水浴锅、可调节移液器、酶标仪、微量玻璃比色皿或微孔板和蒸馏水

二、粗酶液提取：
1.血液样品制备：
血浆：将收集的抗凝血于 4℃，600g 离心 10 分钟，吸取上层血浆到另一支试管中，加入等体积的CB0130M-A, 4℃，8000g 离心 10 分钟,将上清移入新的试管中放置于 4℃待测，若暂时不能完成测试可放于-80℃保存（可保存10天）。
血细胞：将收集的抗凝血于 4℃，600g 离心 10 分钟，弃去上层血浆用 3 倍体积的 PBS 清洗 3 次（用 PBS 重 悬血细胞，600g 离心 10 分钟），加入等体积CB0130M-A，混匀后 4℃放置 10 分钟，8000g 离心 10 分钟，吸取上清放 于 4℃待测，若暂时不能完成测试可放于-80℃保存（可保存 10天）。
2.细胞或组织样品的制备：
细胞：收集不少于10⁶个细胞，首先用 PBS 清洗细胞 2 次（PBS 重悬细胞，600g 离心 10 分钟），加入 3 倍细胞沉淀 体积的CB0130M-A重悬细胞，反复冻融 2-3 次（可在液氮中冻结，37℃水浴中溶解），8000g 离心 10 分钟，收集上清于 4℃待测，若暂时不能完成测试可放于-80℃保存（可保存 10天）。
组织：新鲜组织首先用 PBS 冲洗 2 次，然后称取动物组织或者植物组织 0.1g。加入用CB0130M-A润洗过的匀浆器中（匀浆器提前放冰上预冷）；然后加入 1mL CB0130M-A（组织/CB0130M-A比例保持不变即可），迅速冰上充分研磨（使用液氮研磨效果更好）；8000g ，4℃离心 10min；取上清液放置于 4℃待测，若暂时不能完成测试可放于-80℃保存（可保存10天）。

三、测定步骤：
1.分光光度计或酶标仪预热 30min，调节波长到 412nm，蒸馏水调零。
2.CB0130M-B置于 25℃（一般物种）或者 37℃（哺乳动物）水浴中保温 30min。
3.制作标准曲线：
称取1mg标准品用1mL蒸馏水溶解，浓度为1mg/mL（现配现用）；用CB0130M-A稀释标准品到浓度为200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、0μg/mL。
在微量玻璃比色皿或微孔板中依次加入20μL 各浓度标准品，140μL CB0130M-B，40μL CB0130M-C，混匀后静置2min，检测412nm 处吸光度，根据吸光度 （x） 和浓度（y,μg/mL）做标准曲线。
4.在微量玻璃比色皿或微孔板中加入下列试剂：

注：对照管只需要测定1-2次。

四、计算公式
根据标准曲线，将样本ΔA 带入公式中(x)，计算出样本浓度y(μg/mL)。
(1)按蛋白浓度计算
GSH(μg/mg prot)=y×V样÷(V样×Cpr)=y÷Cpr
(2)按样本质量计算
GSH(μg/g 质量)=y×V样÷(V样÷V样总×W) =y÷W
(3)按细胞数量计算
GSH(μg/10⁶ cell)=y×V样÷(V样÷V样总×细胞数量) =y÷细胞数量
(4)按血浆(血细胞)体积计算
GSH(μg/mL)=2y
V样总：上清液总体积，1mL；V样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02mL；W：样本质量，g；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；细胞数量：以10⁶ 为单位计量；2：血浆(血细胞)体积被稀释一倍。
注意事项：
1.CB0130M-A中含有蛋白质沉淀剂，因此上清液不能用于蛋白浓度测定；若测定蛋白含量，需另取组织。
2.样本处理需匀浆完全，若当天不能完成测量，可放-80℃保存，不超过10d.
3.如果测定吸光值超过线性范围吸光值，可以增加样本量或者稀释样本后再进行测定。

1.如果一次性测定样本数较多，可将CB0099M-A、B、C、D按比例配成混合液。
2.对照管和测定管的测定步骤的区别：对照管加完CB0099M-A、B、C、D、E后必须马上加CB0099M-F；测定管加完CB0099M-A、B、C、D、E后必须反应 20min 后再加CB0099M-F。
3.反应过程中注意避光。
4.由于每一个测定管需要设一个对照管，本试剂盒 100 管保证测 48 个 NADP+ 或 NADPH。
5.最低检测限为 1nmol/mL 或 1nmol/g 鲜重或 0.01nmol/mg prot。
6.本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
7.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。