PEPCK Assay Kit (Microanalysis)

PEPCK催化草酰乙酸生成磷酸烯醇式丙酮酸和CO₂，丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化NADH氧化生成NAD⁺，在340nm下测定NADH下降速率，即可反映PEPCK活性。

100T/96S规格的产品组成及保存条件： 

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

一、自备用品：
分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

二、样本的前处理：
1.细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL CB0281M-ES），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2.组织：按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL CB0281M-ES），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
3.血清（浆）样品：直接检测。

三、测定步骤：
1.分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
2.工作液的配制：临用前将CB0281M-B和CB0282UV-C转移到CB0281M-A中混合溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
3.CB0281M-D的配制：临用前加入1mL蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
4.将工作液和CB0281M-D置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）预热5分钟。
5.测定操作表（在微量石英比色皿或96孔板中加入下列试剂）：

四、PEPCK活性计算：

a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1.血清（浆）PEPCK活力计算
单位定义：每毫升血清（浆）每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。
PEPCK (nmol/min/mL) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷V样÷T = 3215×ΔA
2.组织、细菌或细胞中PEPCK活力计算
(1)按样本蛋白浓度计算：
单位定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。
PEPCK (nmol/min/mg prot) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr)÷T = 3215×ΔA÷Cpr
(2)按样本鲜重计算：
单位定义：每g组织每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。
PEPCK (nmol/min/g 鲜重) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W ×V样÷V样总)÷T = 3215×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算：
单位定义：每1万个细胞每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。
PEPCK (nmol/min/10⁴ cell) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V样÷V样总)÷T =6.43×ΔA
注：V反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.01 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。

b. 用96孔板测定的计算公式如下
1.血清（浆）PEPCK活力计算
单位定义：每毫升血清（浆）每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。
PEPCK (nmol/min/mL) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷V样÷T = 6430×ΔA
2.组织、细菌或细胞中PEPCK活力计算
(1)按样本蛋白浓度计算：
单位定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。
PEPCK (nmol/min/mg prot) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr) ÷T = 6430×ΔA÷Cpr
(2)按样本鲜重计算：
单位定义：每g组织每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。
PEPCK (nmol/min/g 鲜重) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W ×V样÷V样总)÷T = 6430×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算：
单位定义：每1万个细胞每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。
PEPCK (nmol/min/10⁴ cell) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V样÷V样总)÷T = 12.86×ΔA
注：V反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.01 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。

1.蛋白定量测定，建议使用TargetMol生产的BCA Protein Quantification Kit (C0050)。
2.本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
3.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。