PEPC Assay Kit (Microanalysis)

PEPC 催化磷酸烯醇式丙酮酸和 CO₂ 生成草酰乙酸和 HPO₄^2-，苹果酸脱氢酶进一步催化草酰乙酸和NADH 生成苹果酸和NAD⁺，在 340nm 测定 NADH 减少速率，计算 PEPC 活性。

100T/96S规格的产品组成及保存条件：

正式测定前务必取2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

一、自备用品：
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

二、试剂预配制：
CB0134M-B：临用前加入 10mL CB0134M-A和7ml蒸馏水充分混匀，置于 37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴 5min；现配现用。

三、样本前处理：
1.细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴ 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）； 8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2.组织：按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
3.血清（浆）样品：直接检测。

四、测定步骤：
1.紫外分光光度计或酶标仪预热 30min，调节波长到340 nm，蒸馏水调零。
2.CB0134M-C工作液的配制：将CB0134M-C：CB0134M-D =1μL:329μL 稀释，混匀，用多少配多少。
3.按顺序加入下列试剂：

五、PEPC酶活性计算公式：
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1.血清(浆)PEPC 活力计算
单位定义：每毫升血清(浆)每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
PEPC (U/mL) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷V样÷T = 643×ΔA
2.组织、细菌或细胞中 PEPC 活力计算
(1)按样本蛋白浓度计算
单位定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
PEPC (U/mg prot) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr)÷T = 643×ΔA÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
单位定义：每 g 组织每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
PEPC (U/g 鲜重) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W ×V样÷V样总)÷T =643×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算
单位定义：每 1 万个细胞每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
PEPC (U/10⁴ cell) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V样÷V样总)÷T =1.286×ΔA
注： V反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.01 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T： 反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万；10⁹：单位转换系数, 1mol=1×10⁹nmol。
b.用 96 孔板测定的计算公式如下
1.血清(浆)PEPC 活力计算
单位定义：每毫升血清(浆)每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
PEPC (U/mL) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷V样÷T = 1286×ΔA
2.组织、细菌或细胞中 PEPC 活力计算
(1)按样本蛋白浓度计算
单位定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
PEPC (U/mg prot) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr)÷T=1286×ΔA÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
单位定义：每 g 组织每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
PEPC (U/g 鲜重) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W× V样÷V样总)÷T = 1286×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算
单位定义：每 1 万个细胞每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
PEPC (U/10⁴ cell) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V样÷V样总)÷T =2.572×ΔA
注： V反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：96 孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.01 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T： 反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万；10⁹：单位转换系数, 1mol=1×10⁹nmol。

1.本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
2.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。