Oxidized Thioredoxin Reductase Assay Kit (Microanalysis)

TrxR催化NADPH还原DTNB生成TNB和NADP⁺，TNB在412 nm有特征吸收峰，但还原型谷胱甘肽与DTNB同样能反应生成TNB，同时又利用2-乙烯吡啶抑制样本中原有的还原型谷胱甘肽，然后通过测定412nm波长处TNB的增加速率，即可计算TrxR活性。

100T/96S规格的产品组成及保存条件：

正式测定前务必取2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

一、自备用品：
可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96 孔板、水浴锅、天平、烘箱、玻璃管、离心机、可调式液枪、蒸馏水、1XPBS缓冲液。

二、粗酶液提取：
1.组织：按照组织质量（g）：CB0136M-A体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL CB0136M-A）进行冰浴匀浆，8000g，4℃离心 10min，取上清置冰上待测。
2.细菌、细胞：按照细胞数量（10 ⁴个）：CB0136M-A体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL CB0136M-A），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7秒，总时间 3min）；然后 8000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。
3.血清等液体：直接测定。

三、测定步骤：
1.分光光度计预热 30 min，调节波长到 412nm，用蒸馏水调零。
2.CB0136M-A在 25℃（一般物种）或者 37℃（哺乳动物）预热 30min；测定前将样本上清液与CB0136M-D以50：1的体积比混匀（即取100μL上清液加入2μL CB0136M-D混合）37℃水浴30min后至冰上。
3.在微量玻璃比色皿或96孔板加入下列试剂：

注意：空白管只需测定1-2次。

四、TrxR 活性计算公式：
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
(1)按蛋白浓度计算
活性单位定义：在25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分钟催化1nmol DTNB还原为1个酶活单位。
TrxR (U/mg prot) = (ΔA测定管-ΔA空白管)÷ε÷d×10⁹×V反总÷(Cpr×V样)÷T
= 147×(ΔA测定管-ΔA空白管)÷Cpr
(2)按样本质量计算
活性单位定义：在25℃或37℃中，每克样本每分钟催化1nmol DTNB还原为1个酶活单位。
TrxR (U/g) = (ΔA测定管-ΔA空白管)÷ε÷d×10⁹×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T
= 147×(ΔA测定管-ΔA空白管)÷W
(3)按细胞数量计算
活性单位定义：在25℃或者37℃中，每10⁴个细胞每分钟催化1nmol DTNB还原为1个酶活单位。
TrxR (U/10⁴ cell) = (ΔA测定管-ΔA空白管)÷ε÷d×10⁹×V反总÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T
= 147×(ΔA测定管-ΔA空白管)÷细胞数量
(4)按液体体积计算
活性单位定义：在25℃或者37℃中，每毫升液体每分钟催化1nmol DTNB 还原为1个酶活单位。
TrxR (U/mL) = (ΔA测定管-ΔA空白管)÷ε÷d×10⁹×V反总÷V样÷T
= 147×(ΔA测定管-ΔA空白管)
注：ε：TNB 在 412nm 处的摩尔消光系数，1.36×10⁴ L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应体系总体积(L)，200μL=2×10^-4 L；Cpr：上清液蛋白质浓度(mg/mL)，需要另外测定；W ：样品质量；V样：加入反应体系中上清液体积(mL)，20μL=0.02 mL；V样总：提取液体积，1 mL；T：反应时间(min)，5 min；5min；细胞数量：以10⁴为单位，万个；10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol。

b. 使用 96 孔板测定的计算公式如下
(1)按蛋白浓度计算
活性单位定义：在25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分钟催化1nmol DTNB还原为1个酶活单位。
TrxR (U/mg prot) = (ΔA测定管-ΔA空白管)÷ε÷d×10⁹×V反总÷(Cpr×V样)÷T
= 294×(ΔA测定管-ΔA空白管)÷Cpr
(2)按样本质量计算
活性单位定义：在25℃或者37℃中，每克样本每分钟催化1nmol DTNB还原为1个酶活单位。
TrxR (U/g) = (ΔA测定管-ΔA空白管)÷ε÷d×10⁹×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T
= 294×(ΔA测定管-ΔA空白管)÷W
(3)按细胞数量计算
活性单位定义：在25℃或者37℃中，每10 ⁴个细胞每分钟催化1nmol DTNB还原为1个酶活单位。
TrxR (U/10⁴cell) = (ΔA测定管-ΔA空白管)÷ε÷d×10⁹×V反总÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T
= 294×(ΔA测定管-ΔA空白管)÷细胞数量
(4)按液体体积计算
活性单位定义：在25℃或者37℃中，每毫升液体每分钟催化1nmol DTNB 还原为1个酶活单位。
TrxR (U/mL) = (ΔA测定管-ΔA空白管)÷ε÷d×10⁹×V反总÷V样÷T
= 294×(ΔA测定管-ΔA空白管)
注：ε：TNB 在412nm处的摩尔消光系数，1.36×10⁴L/μ mol/cm；d：96 孔板光径，0.5cm；V反总：反应体系总体积(L)，200μL=2×10^-4 L；Cpr：上清液蛋白质浓度(mg/mL)，需要另外测定；W ：样品质量；V样：加入反应体系中上清液体积(mL)，20μL=0.02 mL；V样总：提取液体积，1 mL；T：反应时间(min)，5 min，5min；细胞数量：以10⁴为单位，万个；10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹ nmol。

1.测定前须先取1～2个样做预实验，使得吸光值在5min内程线性变化；哺乳动物组织及血液制品TrxR活力测定时，一般须用蒸馏水稀释5倍左右；测定过程操作须迅速。
2.由于CB0136M-A中含有一定浓度的蛋白（约0.1mg/mL），所以在测定样品蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白。
3.本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
4.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。