NOX Assay Kit (Microanalysis)

Name: NOX Assay Kit (Microanalysis)
Brand: TargetMol
SKU: CB0220M
Rating: 5 (4 reviews)

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产品编号 CB0220M

别名 NADH氧化酶检测试剂盒（微量法）

NADH氧化酶（NADH oxidase，NOX）（EC 1.6.99.3）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，可在氧气存在下，直接将NADH氧化为NAD。该酶不仅参与NAD的再生，而且与免疫反应密切相关。

规格	价格	库存	数量
100 T	¥ 1,100	4-6日内发货

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实验操作小课堂

常见问题解答

检测原理

NOX能够将NADH氧化为NAD⁺，NADH的氧化与2,6二氯酚靛蓝（DCPIP）的还原相偶联，蓝色的DCPIP被还原为无色的DCPIP，在600nm下测定蓝色DCPIP的还原速率计算出NADH氧化酶活性的大小。

产品规格

100T/96S规格的产品组成及保存条件：

编号	规格	储存条件
CB0220M-A	100mL×1瓶	4℃保存；
CB0220M-B	20mL×1瓶	4℃保存；
CB0220M-C	1.5mL×1支	-20℃保存；
CB0220M-D	20mL×1瓶	4℃保存；
CB0220M-E	3 mL×1瓶	4℃保存；
CB0220M-F	粉剂×1瓶	-20℃保存；临用前每瓶加入4.5mL蒸馏水；剩余试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

操作说明

一、自备用品：
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵、冰、蒸馏水。

二、样本的前处理：
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
1.准确称取0.1g组织或收集500万细胞，加入1mL CB0220M-A和10μL CB0220M-C，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2.将匀浆600g，4℃离心5min。
3.弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。
4.上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的NOX（此步可选做）。
5.步骤4 中的沉淀即为线粒体，加入200μL CB0220M-B和2μL CB0220M-C，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10秒，重复30次），用于NOX活性测定，并用于蛋白浓度测定。

三、测定步骤：
1.分光光度计预热30min以上，调节波长至600nm，蒸馏水调零。
2.样本测定
（1）CB0220M-D于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育5min。
（2）操作表：

试剂名称	测定管（μL）
样本	10
CB0220M-D	175
CB0220M-E	25
CB0220M-F	40
混匀，记录600nm处20s时吸光值A1，迅速将比色皿连同反应液一起放入 37℃水浴中，准确反应 1 分钟，迅速取出比色皿并擦干，记录1min20s后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。

四、NOX活力单位的计算：
a. 用微量玻璃比色皿测定的计算
按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白在每mL反应体系中每分钟A600变化0.01定义为一个酶活力单位。
NOX (U/mg prot) = ΔA×V反总÷(V样×Cpr)÷0.01÷T = 2500×ΔA÷Cpr

V反总：反应体系总体积，0.25mL；V样：加入样本体积，0.01mL；T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL

b. 用微量玻璃比色皿测定的计算
按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白在每mL反应体系中每分钟A600变化0.005定义为一个酶活力单位。
NOX (U/mg prot) = ΔA×V反总÷(V样×Cpr)÷0.005÷T = 5000×ΔA÷Cpr

V反总：反应体系总体积，0.25mL；V样：加入样本体积，0.01mL；T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL

注意事项

1.蛋白定量测定，建议使用TargetMol生产的BCA Protein Quantification Kit (C0050)。
2.粗酶液的提取必须在 0℃- 4℃中操作完成，以防止酶变性失活。
3.比色皿中反应液的温度最好保持 37℃，取小烧杯一只装入一定量的 37℃蒸馏水，将此烧杯放入 37℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。
4.最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。
5.实验时，CB0220M-F样本在冰上放置，以免变性和失活。
6.推荐使用样本蛋白浓度计算酶活，若用样本质量计算，则需加测胞浆提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方为总酶活。
使用样本鲜重计算公式：
a 用微量玻璃比色皿测定的计算
单位的定义：每 g 组织在反应体系中每分钟 A600 变化 0.01 定义为一个酶活力单位。
NOX 上清（U/g 质量）=ΔA1÷0.01×V反总÷(W÷V提取×V样)÷T=2525×ΔA1÷W
NOX 沉淀（U/g 质量）=ΔA2÷0.01×V反总÷(W÷V样总×V样)÷T=505×ΔA2÷W
NOX（U/g 质量）= NOX 上清+ NOX 沉淀=2525×ΔA1÷W +505×ΔA2÷W
ΔA1：上清测定值；ΔA2：沉淀测定值；V反总：反应总体积，0.25mL；V样：加入样本体积，0.01mL；V提取：加入提取液体积，1.01mL；V样总：沉淀重悬体积，0.202mL；W：样本质量，g；T：反应时间，1min。
b 用96孔板测定的计算
单位的定义：每 g 组织在反应体系中每分钟 A600 变化 0.005 定义为一个酶活力单位。
NOX 上清（U/g 质量）=ΔA1÷0.005×V反总÷(W÷V提取×V样)÷T=5050×ΔA1÷W
NOX 沉淀（U/g 质量）=ΔA2÷0.005×V反总÷(W÷V样总×V样)÷T=1010×ΔA2÷W
NOX（U/g 质量）= NOX 上清+ NOX 沉淀=5050×ΔA1÷W +1010×ΔA2÷W
ΔA1：上清测定值；ΔA2：沉淀测定值；V反总：反应总体积，0.25mL；V样：加入样本体积，0.01mL；V提取：加入提取液体积，1.01mL；V样总：沉淀重悬体积，0.202mL；W：样本质量，g；T：反应时间，1min。
7.本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
8.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。