NiR Assay Kit (Visible Spectrophotometry)

亚硝酸还原酶可将NO₂^ˉ还原为NO，使样品中参与重氮化反应生成紫红色化合物的NO₂^ˉ减少，即540nm处吸光值的变化可反应亚硝酸还原酶的活性。

50T/24S规格的产品组成及保存条件： 

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

一、自备用品：
可见分光光度计、1mL玻璃比色皿、天平、研钵、常温离心机、恒温水浴锅。

二、酶液提取：
1.组织：按照组织质量（g）：CB0224V-ES体积（mL）为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL CB0224V-ES），进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2.细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴个）：CB0224V-ES体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL CB0224V-ES），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后10000g，4℃离心10min，取上清置于冰上待测。

三、测定步骤：
1.分光光度计预热 30min，调节波长至 540nm。
2.标准液的稀释：将10µmol/mL的标准溶液用蒸馏水等比稀释至0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.05、0.03µmol/mL标准溶液待测。
3.操作表（在EP中加入下列试剂：）

四、NiR活性计算公式：
1.标准曲线的绘制
以标准溶液浓度为 x 轴(x，μmol/mL)，标准溶液对应的 ΔA标准为 y 轴(y，ΔA标准)，建立标准曲线，得到标准方程 y=kx+b，将 ΔA测定带入方程得到 x(μmol/mL)。
2.酶活计算
(1)蛋白浓度计算
酶活单位定义：每mg组织蛋白每小时还原1μmol NO₂ ^ˉ的量为一个酶活力单位。
NiR(U/mg prot)=x×V1÷V2÷Cpr÷T=x×7÷Cpr
(2)按照样本质量计算
酶活单位定义：每g组织每小时还原1μmol NO₂ ^ˉ的量为一个酶活力单位。
NiR(U/g 质量)=x×V1÷V2×V提÷W÷T=x×7÷W
(3)按照细菌/细胞数量计算
酶活单位定义：每104个细菌/细胞每小时还原1μmol NO₂ ^ˉ的量为一个酶活力单位。
NiR(U/10⁴ 质量)=x×V1÷V2×V提÷细菌/细胞数量÷T=x×7÷细菌/细胞数量
V1：取上清液前的反应体系体积，0.7mL；V2：加入的样本体积，0.1mL；V提：加入的提取液体积，1.0mL；T： 反应时间，1h；W：土样质量，g；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；细菌/细胞数量：以10⁴计。

1.配制好的工作液3天内使用完。
2.若吸光值超过3，将上清液进行适当的稀释后再加入工作液显色，并在计算公式中乘以稀释倍数。
3.严格控制显色时间，否则会对结果有影响。
4.本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
5.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。