NADK Assay Kit (UV Spectrophotometry)

NADK催化NAD⁺磷酸化，生成NADP⁺；NADP⁺可被6-磷酸葡萄糖脱氢酶还原为NADPH；在340 nm下测定NADPH增加速率。可反映出NADK活性的大小。

50T/24S规格的产品组成及保存条件： 

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

一、自备用品：
紫外分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL石英比色皿和蒸馏水。

二、样本前处理：
1.细菌、细胞样品的制备：
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：CB0221UV-ES体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL CB0221UV-ES），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2.组织样品的制备：
组织：按照组织质量（g）：CB0221UV-ES体积（mL）为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL CB0221UV-ES），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
3.血清（浆）样品：直接检测。

三、测定步骤：
1.分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
2.将CB0221UV-A和CB0221UV-B 37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴15min以上。
3.工作液Ⅰ的配制：在CB0221UV-C中加入12mL CB0221UV-A，充分混匀待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
工作液Ⅱ的配制：在CB0221UV-D中加入45mL CB0221UV-B，充分混匀待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
4.操作表（在比色皿中加入如下试剂）：

四、NADK活性计算：
1.血清(浆)NADK活力的计算：
单位的定义：每mL血清(浆)每分钟生成1 nmol的NADP定义为一个酶活力单位。
NADK (nmol/min/mL) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷V样÷T = 53.59×ΔA
2.组织、细菌或细胞中NADK活力的计算：
(1)按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生成1 nmol NADP定义为一个酶活力单位。
NADK (nmol/min /mg prot) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr) ÷T = 53.59×ΔA÷Cpr
(2)按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织每分钟生成1 nmol NADP定义为一个酶活力单位。
NADK (nmol/min /g 鲜重) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W× V样÷V样总) ÷T = 53.59×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟生成1 nmol NADP定义为一个酶活力单位。
NADK (nmol/min /10⁴ cell) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V样÷V样总) ÷T = 0.107×ΔA
注：V反总：反应体系总体积，5×10^-4 L；ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.1 mL；V样总：加入CB0221UV-ES体积，1 mL；T：反应时间，15 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。

1.蛋白定量测定，建议使用TargetMol生产的BCA Protein Quantification Kit (C0050)。
2.本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
3.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。