NAD(H) Quantification Assay Kit (Spectrophotometry)

分别用酸性和碱性提取液提取样品中 NAD⁺和 NADH，NADH 通过 PMS 的递氢作用，还原 氧化型噻唑蓝（MTT）为甲瓒，在 570nm 下检测吸光值；而 NAD⁺可被乙醇脱氢酶还原为 NADH，进一步采用 MTT 还原法检测，通过吸光值变化即可定量检测辅酶ⅠNAD (H)的含量。

50T/24S规格的产品组成及保存条件：

正式测定前务必取2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

一、自备用品：

可见分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1ml玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

二、NAD⁺ 和 NADH 的提取：

1.血清（浆）中 NAD⁺和 NADH 的提取：
（1）NAD⁺的提取：按照血清（浆）体积（mL）：酸性提取液体积（mL）为 1：5~10的比例（建议取约 0.1mL 血清（浆），加入 1mL 酸性提取液），95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
（2）NADH 的提取：按照血清（浆）体积（mL）：碱性提取液体积（mL）为 1：5~10的比例（建 议取约 0.1mL 血清（浆），加入 1mL 碱性提取液），95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）； 冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2.组织中 NAD⁺和 NADH 的提取：
（1）NAD⁺ 的提取：按照组织质量（g）：酸性提取液体积（mL）为 1：5~10的比例（建议取约 0.1g 组织，加入 1mL 酸性提取液），冰浴研磨，95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴 中冷却后，10000g 4℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
（2）NADH 的提取：按照组织质量（g）：碱性提取液体积（mL）为 1：5~10的比例（建议取约 0.1g 组织，加入 1mL 碱性提取液），冰浴研磨，95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴 中冷却后，10000g 4℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
3.细胞或细菌中 NAD⁺和 NADH 的提取：
（1）NAD⁺ 的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照细菌或细胞数量（10⁴个）：酸性 提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 酸性提取液）， 超声波破碎 1min（冰浴，强度 20％或 200W，超声 2s，停 1s），95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
（2）NADH 的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照细菌或细胞数量（10⁴个）：碱性提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 碱性提取液），超声波破碎 1min（冰浴，强度 20％或 200W，超声 2s，停 1s），95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

三、测定步骤：
1.分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 570nm，蒸馏水调零。
2.在1.5mL 棕色 EP 管中按下表依次加入下列试剂：

注意事项：
1.对照管和测定管的测定步骤的区别：对照管加完CB0098S-A、B、C、D、E后必须马上加CB0098S-F；测定管加完CB0098S-A、B、C、D、E后必须反应 20min 后再加CB0098S-F。
2.操作及反应过程中注意避光。
3.由于每一个测定管需要设一个对照管，本试剂盒 50 管保证测24个NAD⁺ 或NADH。
4.最好采用新鲜样本进行测定，以准确反映该指标含量。

四、NAD⁺和 NADH 含量的计算：

a. NAD⁺含量的计算：
1.血清(浆)中 NAD⁺含量计算
NAD⁺含量 (nmol/mL) =ΔA测定÷(ΔA标准1÷C标)×V提取×2÷V血清=25×ΔA测定÷ΔA标准1
2.组织、细菌或细胞中 NAD+含量计算
(1)按样本蛋白浓度计算
NAD⁺ (nmol/mg prot) =ΔA测定÷(ΔA标准1÷C标)×V提取×2÷(V提取×Cpr)=2.5×ΔA测定÷ΔA标准1 ÷ Cpr
(2)按样本鲜重计算
NAD⁺ (nmol/g 鲜重) = ΔA测定÷(ΔA标准1÷C标)×V提取×2÷W=2.5×ΔA测定÷ΔA标准1÷W
(3)按细菌或细胞密度计算
NAD⁺ (nmol/10⁴ cell) =ΔA测定÷(ΔA标准1÷C标)×V提取×2÷500=0.005×ΔA测定÷ΔA标准1

b. NADH 含量的计算：
1.血清(浆)中 NADH 含量计算
NADH 含量 (nmol/mL) =ΔA测定÷(ΔA标准2÷C标)×V提取×2÷V血清=25×ΔA测定÷ΔA标准2
2.组织、细菌或细胞中 NADH 含量计算
(1)按样本蛋白浓度计算
NADH (nmol/mg prot) = ΔA测定÷(ΔA标准2÷C标)×V提取×2÷(V提取×Cpr)=2.5×ΔA测定÷ΔA标准2 ÷ Cpr
(2)按样本鲜重计算
NADH (nmol/g 鲜重) = ΔA测定÷(ΔA标准2÷C标)×V提取×2÷W=2.5×ΔA测定÷ΔA标准2÷W
(3)按细菌或细胞密度计算
NADH (nmol/10⁴ cell) =ΔA测定÷(ΔA标准2÷C标)×V提取×2÷500=0.005×ΔA测定÷ΔA标准2
注：C标：NAD或NADH标准溶液的浓度1.25nmol/mL；V提取：加入提取液体积，1mL；2：提取过程中上清液稀释倍数； V 血清：提取时加入的血清体积，0.1mL；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；500：500 万个细胞。

1.本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
2.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。