Mitochondrial Respiratory Chain ComplexI Activity Assay Kit (Microanalysis)

复合体Ⅰ能够催化 NADH 脱氢生成 NAD⁺，在 340nm 下测定 NADH 的氧化速率计算出该酶活性的大小。

一、自备用品：
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、研钵/匀浆器、细胞超声破碎仪、丙酮、冰和蒸馏水。

二、样品测定的前处理：
1.准确称取 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1mL CB0163M-ES-1，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2.将匀浆 600g，4℃离心 10min，弃沉淀，留上清。
3.将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 15min，得到上清液和沉淀。
4.上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅰ（此步可选做）。
5.步骤3中的沉淀即为线粒体，加入 200μL CB0163M-ES-1和 200μL CB0163M-ES-2，超声波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超声 5s，间隔 10 秒，重复15次），用于复合体Ⅰ酶活性测定，并且用于蛋白含量测定。

三、测定步骤：
1.紫外分光光度计/酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，分光光度计蒸馏水调零。
2.样本测定
（1）CB0163M-A于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）预热1 5min。
（2）在微量石英比色皿/96孔板（UV板）中加入10μL 样本、154μL CB0163M-A、20μL 工作液和 16μL CB0163M-D，立即混匀，记录第10s的吸光值A1，迅速将比色皿连同反应液一起放入37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴中准确反应1分钟，之后迅速取出比色皿并擦干，记录1min10s时的吸光度A2，计算ΔA=A1-A2。

四、复合体Ⅰ活力单位的计算：
a．以微量石英比色皿计算：
1.按蛋白浓度计算
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅰ活性 (U/mg prot) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr)÷T=3215.43×ΔA÷Cpr

注：V反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：微量石英比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.01 mL；T：反应时间，1min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol
2.按样本鲜重计算(检测样本数为100T/48S)
单位的定义：每 g 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅰ活性1 (U/g质量) = [ΔA1×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W÷V提取1×V样)÷T =3215.43×ΔA1÷W
复合体Ⅰ活性2(U/g质量)= [ΔA2×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W÷V提取2×V样)÷T=1286.17×ΔA2÷W
复合体Ⅰ总活性(U/g 质量)=3215.43×ΔA1÷W+1286.17×ΔA2÷W
注：ΔA1：上清测定值；ΔA2：沉淀测定值；V反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：微量石英比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.01 mL；V提取1：加入提取液体积，1mL ；V提取2：沉淀重悬体积，(0.2+0.2)0.4mL；T：反应时间，1min；W：样本重量，g；10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol
3.按细胞数量计算(检测样本数为100T/48S)
单位的定义：每 10⁶个细胞在反应体系中每分钟消耗1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅰ活性1 (U/10⁶细胞) = [ΔA1×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(N÷V提取1×V样)÷T =3215.43×ΔA1÷N
复合体Ⅰ活性2(U/10⁶细胞)= [ΔA2×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(N÷V提取2×V样)÷T=1286.17×ΔA2÷N
复合体Ⅰ总活性(U/10⁶细胞)=3215.43×ΔA1÷N+1286.17×ΔA2÷N
注：ΔA1：上清测定值；ΔA2：沉淀测定值；V反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：微量石英比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.01 mL；V提取1：加入提取液体积，1mL ；V提取2：沉淀重悬体积，(0.2+0.2)0.4mL；T：反应时间，1min； N：细胞数量，以10⁶计；10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol
b．以96孔板(UV板)计算：
将公式中的d-1cm改为d-0.5cm进行计算即可。

一、自备用品：
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、研钵/匀浆器、细胞超声破碎仪、丙酮、冰和蒸馏水。

1.蛋白定量测定，建议使用TargetMol生产的BCA Protein Quantification Kit (C0050)。
2.为保证实验结果的准确性，需先取1-2个样做预实验，如果测定的吸光值过高（＞1.5），可用蒸馏水稀释上清液后再测定，计算结果时注意乘以稀释倍数；若ΔA大于0.4，需将样本稀释适当倍数，计算公式中乘以相应稀释倍数；若ΔA偏小，则可以通过增加加入的样本体积来提高灵敏度。
3.样本蛋白浓度需自行测定，在测定样本和提取液蛋白浓度均需要适当的稀释，由于提取液1中含有一定的蛋白（约1mg/mL），所以在计算样本蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白(约0.5mg/ml)，但更建议对样本中的线粒体进行单独裂解并测定蛋白浓度。
4.推荐使用样本蛋白浓度计算酶活。
5.为延长试剂盒使用时间，所以CB0163M-B和CB0163M-D都多给一支。
6.本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
7.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。