Mitochondrial Respiratory Chain Complex IV Activity Assay Kit (Microanalysis)

还原型细胞色素C在550nm 有特征光吸收，线粒体复合体Ⅳ催化还原型细胞色素C生成氧化型细胞色素C，因此 550nm 光吸收下降速率能够反映线粒体复合体Ⅳ酶活性。

100T/96S规格的产品组成及保存条件：

正式测定前务必取2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

一、自备用品：
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

二、样品测定的前处理：
1.准确称取 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1mL CB0095M-A和 10μL CB0095M-C，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2.将匀浆 600g，4℃离心 5min。
3.弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。
4.上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅳ（此步可选做）。
5.步骤4中的沉淀即为线粒体，加入 200μL CB0095M-B和 2μL CB0095M-C，超声波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10 秒，重复 30 次），用于复合体Ⅳ酶活性测定。

三、测定步骤：
1.分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 550nm，分光光度计蒸馏水调零。
2.样本测定
（1）工作液于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）孵育 5min。用不完的试剂 4℃可保存一周；
（2）在微量玻璃比色皿或 96 孔板中加入 10μL 样本和 200μL 工作液，混匀，立即记录 550nm处初始吸光值 A1 和 1min 后的吸光值 A2，计算 ΔA=A1-A2。
注意： 若 ΔA 大于 0.4，需将样本用CB0095V-B稀释适当倍数（计算公式中乘以相应稀释倍数），使 A1-A2 小于 0.4，可提高检测灵敏度；若ΔA偏小，则可以通过增加加入的样本体积来提高灵敏度。

四、复合体Ⅳ活力单位的计算：

a. 使用微量玻璃比色皿测定的计算公式如下：
(1)按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化降解1 nmol 还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅳ活力 (U/mg prot) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr) ÷T=1099×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

(2)按样本鲜重计算(检测样本数为 100T/48S)
单位的定义：每 g 组织每分钟催化降解 1nmol 还原型细胞色素 C 定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅳ活力1(U/g 质量)=[ΔA1×V反总÷(ε×d)×10⁹ ]÷(W÷V提取1×V样)÷T=1099×ΔA1÷W
复合体Ⅳ活力2 (U/g 鲜重) = [ΔA2×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W÷V提取2× V样)÷T=220×ΔA2÷W
复合体Ⅳ总活力(U/g 质量)=1099×ΔA1÷W+220×ΔA2÷W
注：V反总：反应体系总体积，2.1×10^-4 L；ε：细胞色素 C 摩尔消光系数，1.91×10⁴ L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.01 mL；T：反应时间，1 min；ΔA1：上清测定值；ΔA2：沉淀测定值；V提取1：加入提取液体积，1.01mL；V提取2：加入提取液体积，0.202mL。Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol。

b. 使用 96 孔板测定的计算公式如下：
(1)按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化降解1 nmol还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅳ活力 (U/mg prot) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr) ÷T=2198×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

(2)按样本鲜重计算(检测样本数为 100T/48S)
单位的定义：每 g 组织每分钟催化降解 1nmol 还原型细胞色素 C 定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅳ活力 1(U/g 质量)=[ΔA1×V反总÷(ε×d)×10⁹ ]÷(W÷V提取1×V样)÷T=2198×ΔA1÷W 复合体Ⅳ活力 2(U/g 质量)=[ΔA2×V反总÷(ε×d)×10⁹ ]÷(W÷V提取2×V样)÷T=440×ΔA2÷W
复合体Ⅳ总活力(U/g 质量)=2198×ΔA1÷W+440×ΔA2÷W
注：V反总：反应体系总体积，2.1×10^-4 L；ε：细胞色素C摩尔消光系数，1.91×10⁴ L/mol/cm；d：96 孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.01 mL；T：反应时间，1 min；ΔA1：上清测定值；ΔA2：沉淀测定值；V提取1：加入提取液体积，1.01mL；V提取2：加入提取液体积，0.202mL；T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol。

1.蛋白定量测定，建议使用TargetMol生产的BCA Protein Quantification Kit (C0050)。
2.本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
3.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。