Mitochondrial Respiratory Chain Complex IIIActivity Assay Kit (Microanalysis)

与氧化型细胞色素 C 不同，还原型细胞色素C在 550nm 有特征光吸收，因此 550nm 光吸收增加速率能够反映线粒体复合体Ⅲ酶活性。

100T/48S规格的产品组成及保存条件：

正式测定前务必取2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

一、自备用品：
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板（非聚苯乙烯材质）、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

二、样品处理：
1.准确称取 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1mL CB0162M-提取液，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2.将匀浆 600g，4℃离心 10min。
3.弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 15min。
4.上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅲ（此步可选做）。
5.步骤4中的沉淀即为线粒体，加入 200μL CB0162M-提取液，超声波破碎（功率 20％或 200W，超声5S，隔 10 秒，重复15次），用于复合体Ⅲ酶活性测定，并且用于蛋白含量测定。

三、测定步骤：
1.分光光度计/酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 550nm，分光光度计蒸馏水调零；
2.样本测定：

四、复合体Ⅲ活性单位的计算：

a.按微量玻璃比色皿计算：
(1)按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化产生1 nmol还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅲ活性 (U/mg prot) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(Cpr×V样)÷T = 262×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

V反总：反应体系总体积，2×10^-4L；ε：细胞色素C摩尔消光系数，1.91×10⁴L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.02mL；T：反应时间，2min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol。
(2)按样本鲜重计算(检测样本数为100T/24S)：
单位的定义：每 g 组织每分钟催化产生 1nmol 还原型细胞色素 C 定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅲ活性1(U/g 质量)=[ΔA1×V反总÷(ε×d)×10⁹ ]÷(W÷V提取1×V样)÷T=262×ΔA1÷W
复合体Ⅲ活性2(U/g 质量)=[ΔA2×V反总÷(ε×d)×10⁹ ]÷(W÷V提取2×V样)÷T=52×ΔA2÷W
复合体Ⅲ总活性 (U/g 质量) =262×ΔA1÷W+52×ΔA2÷W
注：ΔA1：上清测定值；ΔA2：沉淀测定值；V反总：反应体系总体积，0.001L；ε：细胞色素 C 摩尔消光系数，1.91×10⁴ L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.1mL；V提取1：加入提取液体积，1.0 mL；V提取2：沉淀重悬体积，0.2 mL；T：反应时间，2 min； W：样本质量，g；10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol。

b.按微量玻璃比色皿计算：
将上述公式中的d-1cm 改为d-0.5cm 进行计算即可。

1.蛋白定量测定，建议使用TargetMol生产的BCA Protein Quantification Kit (C0050)。
2.为保证实验结果的准确性，需先取1-2个样做预实验，如果测定的吸光值＞1，建议将样本用提取液稀释后测定，计算结果时注意乘以稀释倍数；
3.尽量保持比色皿内反应液温度在 37℃或 25℃。可以在记录初始吸光度 A1 后迅速将比色皿连同反应液一起放入 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴中准确反应 2 分钟，之后迅速取出比色皿并擦干，记录 2min 时的吸光度。
4.样本蛋白浓度需自行测定，在测定样本和提取液蛋白浓度均需要适当的稀释，由于提取液中含有一定的蛋白（约1mg/mL），所以在计算样本蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白，但更建议对样本中的线粒体进行单独裂解并测定蛋白浓度。
5.推荐使用样本蛋白浓度计算酶活，若用样本质量计算，则需加测胞浆提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方为总酶活。
6.本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
7.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。