LAP Assay Kit (Visible Spectrophotometry)

LAP分解L-亮氨酰对硝基苯胺生成对硝基苯胺，后者在405nm有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算LAP活性。

50T/48S规格的产品组成及保存条件： 

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

一、自备用品：
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

二、样本的前处理：
1.细菌、细胞样品的制备：细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：CB0225V-ES体积（mL）为1000~5000：1的比例（建议2000万细菌或细胞加入1mL CB0225V-ES），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2.组织样品的制备：按照组织质量（g）：CB0225V-ES体积（mL）为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL CB0225V-ES），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
3.血清（浆）样品：直接检测。

三、测定步骤：
1.分光光度计预热30min以上，调节波长至405nm，蒸馏水调零。
2.将CB0225V-B转移至CB0225V-A中充分溶解（如较难溶解，可50℃水浴加热约30min促进溶解）；在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴10min以上；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
3.在1mL玻璃比色皿中加入250μL样本和750μL CB0225V-A，混匀后立即记录405nm处初始吸光值A1和 2min后的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1。

注意事项：若ΔA大于0.5，需将酶液用提取液稀释，计算公式中乘以相应稀释倍数。使A2-A1小于0.5，可提高检测灵敏度。

四、LAP活力单位的计算：
1.血清(浆)LAP活力的计算：
单位的定义：每mL血清(浆)每分钟生成1 nmol的对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。
LAP (nmol/min/mL) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷V样÷T = 205.8×ΔA
2.组织、细菌或细胞中LAP活力的计算：
(1)按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生成1 nmol 对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。
LAP(nmol/min /mg prot) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr) ÷T = 205.8×ΔA÷Cpr
(2)按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织每分钟生成1 nmol 对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。
LAP(nmol/min /g 鲜重) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W× V样÷V样总) ÷T = 205.8×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟生成1 nmol 对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。
LAP(nmol/min /10⁴ cell) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(2000×V样÷V样总) ÷T = 0.103×ΔA
注：V反总：反应体系总体积，1×10-3 L；ε：对硝基苯胺摩尔消光系数，9.72×103 L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.25 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；2000：细菌或细胞总数，2000万。

1.蛋白定量测定，建议使用TargetMol生产的BCA Protein Quantification Kit (C0050)。
2.本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
3.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。