100 mL规格的产品组成如下：

用于体外构建人胰腺导管癌类器官模型，支持药物筛选及肿瘤发生发展机制研究。

建议首次使用时将培养基添加剂全部加入基础培养基中，混匀后按每管10–15 mL分装，-20℃保存，避免反复冻融。

一、原代培养
1.准备4℃预冷的组织保存液（1–2 mL）取样瓶，取材后的乳腺癌组织应立即置入取样瓶中，冰上快速转运至洁净实验室进行后续处理与细胞分离，并完成拍照及信息登记。
2.提前准备若干培养皿，加入4℃预冷的PBS（含三抗）备用。
3.在超净台内将取样瓶外表面消毒后，转移组织至培养皿中。使用新鲜组织清洗液（1–3 mL）清洗2–3次，去除可见非肿瘤组织后，用无菌手术剪将组织剪切为约1–3 mm³的小组织块。
4.加入人胰腺导管癌原代组织消化液（1–5 mL，依据组织量调整；约黄豆大小组织建议使用1 mL），于37℃条件下振荡消化1–2 h，并实时观察消化进程。
5.取10–20 μL消化液于显微镜下观察，当可见较多单细胞或<70 μm细胞团时，加入3倍体积预冷 PBS（含三抗）终止消化。
注：若消化体系较为黏稠，可加入DNase I继续消化3–5 min。
6.使用100 μm细胞筛网过滤，收集滤液后加入3–5 mL类器官单细胞清洗液，400 g离心5 min，弃上清；随后重复清洗1次。
注：若细胞量较少，可省略重复清洗步骤。
7.如细胞沉淀中存在红细胞，加入快速红细胞裂解液，轻轻吹打混匀5–8次后置冰上裂解2 min。加入3–5 mL类器官单细胞清洗液终止反应，400 g离心5 min，弃上清。
8.基质胶重悬与铺板：进行细胞计数后，按每2000–5000个细胞加入8–15 μL基质胶，混匀后垂直滴加至预热的96孔板孔中心（全程冰上操作）。
9.接种完成后，将96孔板倒置置于37℃培养箱中固化20–30 min，随后轻轻加入室温预平衡的人胰腺导管癌类器官培养基进行培养。
注：
a) 培养基置于4℃保存后应尽快使用，或提前分装并于-20℃冻存，避免反复冻融。
b) 培养基建议每2–4天更换一次（可半量或全量换液），以维持细胞因子活性并促进类器官生长与扩增。
二、类器官传代培养
1.类器官建议每1–4周传代一次。吸去培养基后，使用预冷PBS清洗2–3次。每孔加入100 μL预冷的TrypLE Express酶，用200 μL移液枪轻柔吹打使其分散，室温孵育1–5 min。随后再次轻柔吹打重悬，将细胞收集至15 mL离心管中，加入5–10 mL预冷PBS，于4℃条件下300–400 g离心5 min，弃去上清。
可选机械法传代（适用于类器官数量较少或需快速扩增的情况，机械法处理后类器官通常为小团块状态，重新铺板后有利于快速恢复与扩增）：吸去培养基后，用预冷PBS清洗2–3次。每孔加入100 μL预冷PBS或类器官传代消化液，用移液枪轻柔吹打使类器官分散，转移至15 mL离心管中。加入5–10 mL预冷PBS，于4℃条件下300–400 g离心5 min，弃去上清。
2.收集的类器官沉淀加入适量基质胶重悬，推荐传代比例为1:1至1:6。按原代接种方法操作，每孔加入10–15 μL基质胶铺板，于37℃培养箱中静置10–15 min完成凝胶化。随后取出培养板，在超净台中每孔加入100–200 μL人胰腺导管癌类器官培养基，置于37℃培养箱中继续培养扩增。
三、类器官冻存
按“传代培养”步骤收集类器官细胞沉淀后，加入适量类器官冻存液，使用移液枪轻柔吹打重悬，转移至细胞冻存管中。将冻存管置于程序降温冻存盒中，先于-80℃冰箱过夜保存，随后转入液氮罐中进行长期保存。
注：冻存密度建议：以96孔板培养为例，每2–4孔类器官合并冻存为1管，每管体积约1–2 mL。
四、类器官复苏
1.从液氮罐中取出冻存的类器官细胞，立即置于37℃水浴中快速复苏，并轻轻水平晃动冻存管，使其在1–2 min内完全融解。
注：避免倒置冻存管，以防污染。
2.融解完成后，使用移液枪轻柔吹打细胞2–5次，迅速转移至15 mL离心管中，加入1–5 mL类器官单细胞清洗液，300 g离心5 min，弃去上清。可重复清洗一次，以进一步去除冻存液残留。
3.向细胞沉淀中加入适量人胰腺导管癌类器官培养基重悬，转移至1.5 mL离心管中，300 g离心5 min，弃去上清。
4.使用基质胶重悬细胞，并按原代接种方法进行铺板：每孔加入10–15 μL基质胶混悬液，于37℃培养箱中静置10–15 min完成凝胶化。随后取出培养板，在超净台内每孔加入100–200 μL人胰腺导管癌类器官培养基，置于37℃培养箱中继续培养扩增。

4℃可保存三个月，-20℃可保存一年。

1. 注意无菌操作，防止微生物污染。
2. 组织消化要温和适度，避免过度消化影响细胞活性与类器官形成效率。
3. 使用新鲜配制的完全培养基，按时更换，避免反复冻融关键添加物。
4. 基质胶需全程低温操作，避免提前凝胶化，铺板后及时转入培养箱。
5. 本品仅适用于专业科研用途，严禁用于临床诊断、治疗、食品或药品领域，且不得存放于住宅等非专业场所。
6. 本产品对皮肤、眼睛和呼吸道有刺激性，为保障操作安全与人员健康，操作时请务必穿戴实验服并佩戴一次性手套。