Glutathione S-transferase Assay Kit (Microanalysis)

GST催化GSH与CDNB结合，其结合产物的光吸收峰波长为340nm；通过测定340nm波长处吸光度上升速率，即可计算出GST活性。

100T/96S规格的产品组成及保存条件： 

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

一、自备用品：
紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板（UV板）、水浴锅、可调式移液枪、研钵、冰和双蒸水。

二、粗酶液提取：
1.细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴ 个）：CB0124M-A体积（mL）为 500~1000：1 的比例，建议 500 万细菌或细胞加入 1mL CB0124M-A，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率300W，超声 3s，间隔 7s，总时间3min）；然后8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2.组织：称取约 0.1g 组织，加入 1mL CB0124M-A，进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
3.血清（浆）样品：直接检测。

三、测定步骤：
1.分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。
2.CB0124M-C放在 25℃（一般物种）或者 37℃（哺乳动物）保温。
3.样本测定，取微量石英比色皿或 96 孔板（UV板），加入下列试剂：

注意：空白管只需测定1-2次。

四、GST酶活性计算：
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1.按蛋白浓度计算
活性单位定义：在 25℃或者 37℃中，每毫克蛋白每分钟催化 1μmol CDNB与GSH结合为1个酶活单位。
计算公式：GST (U/mg prot) = [(A4-A3)-(A2-A1)]÷ε÷d×10⁶ ×V反÷(Cpr×V样)÷T =0.23×[(A4-A3)-(A2-A1)] ÷Cpr
2.按样本质量计算
活性单位定义：在 25℃或者 37℃中，每克样品每分钟催化 1μmol CDNB与GSH结合为1个酶活单位。
计算公式：GST (U/g) = [(A4-A3)-(A2-A1)]÷ε÷d×10⁶ ×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T = 0.23×[(A4-A3)-(A2-A1)]÷W
3.按细胞数量计算
活性单位定义：在 25℃或者 37℃中，每10⁴个细胞每分钟催化 1μmol CDNB与GSH结合为1个酶活单位。
计算公式：GST (U/10⁴ cell) = [(A4-A3)-(A2-A1)]÷ε÷d×10⁶ ×V反总÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T
= 0.23×[(A4-A3)-(A2-A1)] ÷细胞数量
4.按液体体积计算
活性单位定义：在 25℃或者 37℃中，每毫升液体每分钟催化 1μmol CDNB与GSH 结合为1个酶活单位。
计算公式：GST (U/mL) = [(A4-A3)-(A2-A1)]÷ε÷d×10⁶ ×V反总÷V样÷T = 0.23×[(A4-A3)-(A2-A1)]
注： ε：产物摩尔消光系数，9.6×10³ L/mol /cm；d：比色皿光径，1cm；10⁶：1mol=1×10 ⁶ μmol；V反总：反应体系总体积，220μL=2.2×10^-4 L；Cpr：上清液蛋白质浓度(mg/mL)；W ：样品质量；V样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02 mL；V样总：提取液体积，1 mL；T：反应时间(min)，5min。

b. 用 96 孔板测定的计算公式如下
1.按蛋白浓度计算
活性单位定义：在 25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分钟催化 1μmol CDNB与GSH 结合为1个酶活单位。
计算公式：GST (U/mg prot) = [(A4-A3)-(A2-A1)]÷ε÷d×10⁶ ×V反总÷(Cpr×V样)÷T = 0.38×[(A4-A3)-(A2-A1)] ÷Cpr
2.按样本质量计算
活性单位定义：在 25℃或者 37℃中，每克样品每分钟催化 1μmol CDNB 与GSH结合为 1个酶活单位。
计算公式：GST (U/g) = [(A4-A3)-(A2-A1)]÷ε÷d×10⁶ ×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T = 0.38×[(A4-A3)-(A2-A1)] ÷W
3.按细胞数量计算
活性单位定义：在 25℃或者 37℃中，每10⁴个细胞每分钟催化 1μmol CDNB与GSH结合为1个酶活单位。
计算公式：GST (U/10⁴ cell) = [(A4-A3)-(A2-A1)]÷ε÷d×10⁶ ×V反总÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T =0.38×[(A4-A3)-(A2-A1)] ÷细胞数量
4.按液体体积计算
活性单位定义：在 25℃或者 37℃中，每毫升液体每分钟催化 1μmol CDNB 与GSH结合为1个酶活单位。
计算公式：GST (U/mL) = [(A4-A3)-(A2-A1)]÷ε÷d×10⁶ ×V反总÷V样÷T = 0.38×[(A4-A3)-(A2-A1)]
注： ε：产物摩尔消光系数，9.6×10³ L/mol /cm；d：96 孔板光径，0.6cm；10 ⁶：1mol=1×10⁶ μmol；V反总：反应体系总体积，220μL=2.2×10^-4 L；Cpr：上清液蛋白质浓度(mg/mL)；W ：样品质量；V样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02 mL；V样总：提取液体积，1 mL；T：反应时间(min)，5min。

1.蛋白定量测定，建议使用TargetMol生产的BCA Protein Quantification Kit (C0050)。
2.样品处理等过程均需要在冰上进行，且须在当日测定酶活力；
3.细胞中 GST 活性测定时，细胞数目须在 300万-500万之间，细胞中 GST 的提取时可加CB0124M-A后研磨或超声波处理，不能用细胞裂解液处理细胞；
4.测定前先用 1～2 个样做预实验，若吸光度大于1，需对样品用蒸馏水稀释，计算结果乘以稀释倍数；
5.测定反映的温度对测定结果有影响，请控制在 25℃或者 37℃（哺乳动物）。
6.本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
7.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。