Glutathione Peroxidase Assay Kit (Spectrophotometry)

GPX 催化 H₂O₂ 氧化 GSH，产生 GSSG；GSH 能与 DTNB 生成在 412nm 处有特征吸收峰的化合物，412nm 下吸光度的下降即可反应 GPX 的活性。

50T/24S规格的产品组成及保存条件：

正式测定前务必取2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

一、自备用品：
可见分光光度计、天平、1ml玻璃比色皿、离心机、水浴锅、可调式移液枪、研钵、冰和双蒸水。

二、粗酶液提取：
1.细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴ 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率300W，超声 3s，间隔 7s，总时间3min）；然后5000 rpm，4℃离心 10min（若上清不清澈可以延长离心时间），取上清，置冰上待测。
2.组织：按照组织质量（g）：CB0086S-ES提取液体积（mL）为 1:5~10 的比例（建议称取 0.1 g 组织，加入 1 mL 提取液）进行冰浴匀浆，5000 rpm，4℃离心 10 min（若上清不清澈可以延长离心时间），取上清置冰上待测。
3.血清（浆）样品：直接检测。

三、测定步骤：
1.分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 412nm，蒸馏水调零。
2.将 80 μmol/mL 标准液用稀释液稀释为 0.08 μmol/mL 的标准溶液，现用现配。
3.测定操作表：

四、GPX酶活性计算：
1.抑制百分率的计算：
抑制百分率=(A对照管-A测定管) ÷(A对照管-A空白管)× 100%
尽量使样本的抑制百分率在 30-70%范围内，越靠近 50%越准确。如果计算出来的抑制百分率小于 30%或大于 70%，则通常需要调整加样量后重新测定。如果测定出来的抑制百分率偏高，则需适当稀释样本；如果测定出来的抑制百分率偏低，则需重新准备浓度比较高的待测样本。
2.GPX 活性计算：
(1)按蛋白浓度计算
GPX活性单位定义：每mg蛋白每分钟催化 1nmol GSH 氧化为 1 个酶活单位。
计算公式：GPX (U/mg prot) =ΔA测定÷(ΔA标准÷C 标)×1000×V酶促÷(Cpr×V样)÷T =200×ΔA测定÷ΔA标准÷Cpr
(2)按样本质量计算
GPX活力单位定义：每g样本每分钟催化 1nmol GSH 氧化为 1 个酶活单位。
计算公式：GPX (U/g) = ΔA测定÷(ΔA标准÷C 标)×1000×V 酶促÷(V样÷V样总×W)÷T
=200×ΔA测定÷ΔA标准÷W
(3)按细胞数量计算
GPX活性单位定义：每10⁴个细胞每分钟催化 1nmol GSH 氧化为 1 个酶活单位。
计算公式：GPX (U/10⁴ cell) =ΔA测定÷(ΔA标准÷C 标)×1000×V酶促÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T =200×ΔA测定÷ΔA标准÷细胞数量
(4)按液体体积计算
GPX活性单位定义：每毫升液体每分钟催化 1nmol GSH 氧化为 1 个酶活单位。
计算公式：GPX (U/mL) =ΔA测定÷(ΔA标准÷C 标)×1000×V 酶促÷V样÷T=200×ΔA测定÷ΔA标准
注：C标：标准液混合物的浓度：0.08 μmol/mL；V酶促：酶促反应体系体积，1.25 mL；V样：酶促反应中加入样本体积，0.1 mL；V样总：提取液体积，1 mL；Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL；T：反应时间，5 min；细胞数量：以万计；W：样本质量，g；1000：换算系数，1 μmol=1000 nmol。

1.样品处理等过程均需要在冰上进行，且须在当日测定酶活力；
2.吸光度若大于 1.2 时，建议将样本用提取液稀释后进行测定。
3.建议一次不要做过多样本以免检测时间过长影响显色，使测定不准确。
4.本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
5.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。