Glutathion Reductases Assay Kit (Microanalysis)

GR 能催化 NADPH 还原 GSSG 再生 GSH，同时 NADPH 脱氢生成 NADP⁺；NADPH 在 340 nm有特征吸收峰，相反 NADP⁺在该波长无吸收峰；通过测定 340 nm 吸光度下降速率来测定 NADPH 脱氢速率，从而计算 GR 活性。

100T/96S规格的产品组成及保存条件：

正式测定前务必取2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

一、自备用品：
紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板（UV板）、水浴锅、可调式移液枪、研钵、冰和双蒸水。

二、粗酶液提取：
1.细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴ 个）：CB0125M-A体积（mL）为 500~1000：1 的比例，建议 500 万细菌或细胞加入 1mL CB0125M-A，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率300W，超声 3s，间隔 7s，总时间3min）；然后8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2.组织：称取约 0.1g 组织，加入 1mL CB0125M-A，进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
3.血清（浆）样品：直接检测。

三、测定步骤：
1.分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。
2.CB0125M-A置于 25℃（普通物质）或者 37℃（哺乳动物）水浴中预热 30min。
3.样本测定按下表依次加入下列试剂：

注意：空白管只需测定一次。

四、GR酶活性计算：
a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1.按蛋白浓度计算
活性单位定义：一定温度中，pH8.0条件下，每mg蛋白每分钟催化1µmol NADPH 氧化为1个酶活单位。
计算公式：GR (U/mg prot) = [(△A测定管-△A空白管)÷ε÷d×V反总×10⁶]÷(Cpr×V样)÷T = 0.536×(△A测定管-△A空白管)÷Cpr
2.按样本质量计算
活力单位定义：一定温度中，pH8.0条件下，每g样本每分钟催化1µmol NADPH氧化为1个酶活单位。
计算公式：GR (U/g) = [(△A测定管-△A空白管)÷ε÷d×V反总×10⁶]÷(W×V样÷V样总)÷T = 0.536×(△A测定管-△A空白管)÷W
3.按细胞数量计算
活性单位定义：一定温度中，pH8.0条件下，每10⁴个细胞每分钟催化1µmol NADPH 氧化为 1 个酶活单位。
计算公式：GR (U/10⁴ cell) = [(△A测定管-△A空白管)÷ε÷d×V反总×10⁶]÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T = 0.536×(△A测定管-△A空白管)÷细胞数量
4.按液体体积计算
活性单位定义：一定温度中，pH8.0条件下，每毫升液体每分钟催化1µmol NADPH氧化为1个酶活单位。
计算公式：GR (U/mL) = [(△A测定管-△A空白管)÷ε÷d×V反总×10⁶]÷V样÷T = 0.536×(△A测定管-△A空白管)
注：ε：NADPH 摩尔消光系数6.22×10 ³ L/mol/cm；d：比色皿光径，1 cm；V反总：反应体系总体积，200μL=2×10 ^-4 L；10 ⁶ ：1 mol=1×10 ⁶μmol；Cpr：上清液蛋白浓度(mg/mL)；W ：样品质量；V样：加入反应体系中上清液体积，20μL =2×10 ^-2 mL；V样总：提取液体积，1mL；V样总：提取液体积，1 mL；T：反应时间，3 min。
b.使用 96 孔板测定的计算公式如下
1.按蛋白浓度计算
活性单位定义：在一定温度中，pH8.0 条件下，每毫克蛋白每分钟催化1µmol NADPH氧化为1个酶活单位。
GR 酶活 (U/mg prot) = [ (△A测定管-△A空白管)÷ε÷d×V反总×10⁶]÷[Cpr×V样]÷T
=1.072×(△A测定管-△A空白管)÷Cpr
2.按样本质量计算
活性单位定义：在一定温度中，pH8.0 条件下，每克样本每分钟催化1µmol NADPH氧化为1个酶活单位。
GR 酶活 (U/g) = [ (△A测定管-△A空白管)÷ε÷d×V反总×10⁶] ÷(W×V样÷V样总)÷T=1.072×(△A测定管-△A空白管)÷W
3.按细胞数量计算
活性单位定义：在一定温度中，pH8.0条件下，每10 ⁴个细胞每分钟催化 1µmol NADPH 氧化为1 个酶活单位。
GR 酶活 (U/10⁴ cell) = [ (△A测定管-△A空白管)÷ε÷d×V反总×10⁶]÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T =1.072×(△A测定管-△A空白管)÷细胞数量
4.按液体体积计算
活性单位定义：在一定温度中，pH8.0 条件下，每毫升液体每分钟催化1µmol NADPH 氧化为1个酶活单位。
GR 酶活 (U/mL) = [ (△A测定管-△A空白管)÷ε÷d×V反总×10⁶]÷×V样÷T =1.072×(△A测定管-△A空白管)
注：ε：NADPH 摩尔消光系数6.22×10 ³ L/mol/cm；d：96 孔板光径，0.5 cm；V反总：反应体系总体积，200μL=2×10^-4 L；10⁶：1mol=1×10 ⁶μmol； Cpr：上清液蛋白浓度(mg/mL)；W ：样品质量；V样：加入反应体系中上清液体积，20μL =2×10^-2 mL；V样总：提取液体积，1mL；V样总：提取液体积，1 mL；T：反应时间，3 min。

1.样品处理等过程均需要在冰上进行，且须在当日测定酶活力，匀浆液避免反复冻融；
2.CB0125M-B须临用前配制，配制完后，置于冰上，未使用完的 4℃保存，三天内使用完。
3.测定前须先用 1～2 个样做预实验，确保 180s 内吸光值变化呈线性，哺乳动物组织一般须用CB0125M-A稀释 2～5 倍；
4.细胞中 GR活性测定时，细胞数目须在 300万-500万之间，细胞中 GR的提取时可加CB0125M-A后研磨或超声波处理，不能用细胞裂解液处理细胞。
5.CB0125M-A 中含有一定浓度的蛋白（约 0.1 mg/mL），测定样品蛋白浓度时需减去本身的蛋白含量。
6.本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
7.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。