Glutamate Synthase Assay Kit (Microanalysis)

谷氨酸合成酶 (GOGAT) 催化谷氨酰胺的氨基转移到α-酮戊二酸形成两分子的谷氨酸；同时 NADH 氧化生成 NAD⁺，在340nm 吸光度的下降速率可以反映 GOGAT 活性大小。

100T/96S规格的产品组成及保存条件：

一、自备用品：
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、微量石英比色皿/96孔板、水浴锅、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和双蒸水

二、粗酶液提取：
1.细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴ 个）：提取液CB0084M-ES体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液CB0084M-ES），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；10000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2.组织：按照组织质量（g）：提取液CB0084M-ES体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入1mL 提取液CB0084M-ES），进行冰浴匀浆；10000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

三、测定步骤：
1.紫外分光光度计/酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。
2.样本测定：
取 20μL 样本和 180μL 工作液于 1mL 比色皿中，混匀，加工作液的同时开始计时，在340 nm 波长下记录 20 秒时的初始吸光度 A1，比色后迅速将比色皿连同反应液一起放入 25℃水浴或培养箱中准确反应 5 分钟；迅速取出比色皿并擦干，340nm下比色，记录 5 分 20 秒时的吸光度 A2，计算ΔA=A1-A2。

四、GOGAT 活性计算：
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1.按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
GOGAT (U/mg prot) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样× Cpr) ÷T = 321.5×ΔA÷Cpr
2.按样本鲜重计算：
单位的定义：每 g 组织每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
GOGAT (U/g 鲜重) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W ×V样÷V样总)÷T = 321.5×ΔA÷W
3.按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
GOGAT (U/10⁴ cell) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V样÷V样总)÷T = 0.643×ΔA
注：V反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.02 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量(g)；500：细菌或细胞总数，500 万；10⁹：单位换算系数，1mol =10⁹nmol。
b. 用 96 孔板测定的计算公式如下
1.按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
GOGAT (U/mg prot) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr) ÷T = 643×ΔA÷Cpr
2.按样本鲜重计算：
单位的定义：每 g 组织每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
GOGAT (U/g 鲜重) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W×V样÷V样总)÷T = 643×ΔA÷W
3.按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
GOGAT (U/10⁴ cell) = [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V样÷V样总)÷T =1.286×ΔA
注： V反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.02 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量(g)；500：细菌或细胞总数，500 万, 10⁹：单位换算系数，1mol =10⁹nmol。

1.测定期间样本在冰上放置，以免变性和失活。
2.最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。
3.当A1大于1.5或者ΔA大于0.6时，建议将样本用蒸馏水稀释后测定，当ΔA 过小时，可以延长
酶促反应时间（10min或15min）或者加大加入的样本体积进行测量。
4.由于提取液中含有一定浓度的蛋白（约 1mg/mL），所以在测定样品蛋白浓度时需要减去提取液本身
的蛋白含量。
5.本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
6.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。