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常见问题解答
Dehydroascorbate Reductase Activity Assay Kit (Microanalysis)
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产品编号 CB0065M
别名 脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)活性检测试剂盒（微量法）
脱氢抗坏血酸还原酶（dehydroascorbate reductase，DHAR）存在于细胞质、线粒体和叶绿体中。DHAR 催化 GSH 还原 DHA 生成 AsA 和 GSSG，调控细胞 AsA/DHA 比值，是抗坏血酸-谷胱甘肽氧化还原循环的关键酶。提高植物体内的 DHAR 活性，可提高植物食品中 AsA 含量，进而提高植物食品的营养品质。
| 规格 | 价格 | 库存 | 数量 |
|---|---|---|---|
| 100 T | ¥ 2,333 | 4-6日内发货 |
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检测原理
DHAR 催化 GSH 还原 DHA 生成 AsA，通过测定 DHA 减少速率，计算 DHAR 活性。
产品组成
100T/96S规格的产品组成如下：
| 组成 | 规格 | 储存条件 |
|---|---|---|
| CB0065M-A | 100mL×1瓶 | 4℃保存。 |
| CB0065M-B | 15mL×1瓶 | 4℃保存。 |
| CB0065M-C | 粉剂×1瓶 | -20℃避光保存，临用前加入 2.5mL 蒸馏水充分溶解。 |
| CB0065M-D | 粉剂×1瓶 | 4℃保存，临用前加入 2.5mL 蒸馏水充分溶解。 |
操作说明
一、自备用品：
紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板（UV板）、低温离心机、研钵、水浴锅、可调式移液枪、冰和蒸馏水。
二、粗酶液提取：
1.组织样本：
按照组织质量（g）：CB0065M-A体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入1mL CB0065M-A）进行冰浴匀浆；8000g，4℃离心 10min，取上清置冰上待测。
2.细菌、细胞样本：
细菌、细胞：按照细胞数量（104 个）：CB0065M-A体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议500 万细胞加入 1mL CB0065M-A），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；8000g 4℃离心 20min，取上清液置冰上混匀待测。
3.液体样本：直接测定。
三、测定步骤：
1.紫外分光光度计/酶标仪预热 30 min，调节波长到 265nm，蒸馏水调零。
2.CB0065M-B在 25℃水浴锅中预热 30 min。
3.在微量石英比色皿/96 孔板中依次加入：
| 试剂名称 | 测定管 (μL) |
|---|---|
| 上清液 | 20 |
| CB0065M-C | 20 |
| CB0065M-D | 20 |
| CB0065M-B | 140 |
| 迅速混匀后于 265nm 比色，记录 30s 和 150s 的吸光值 A1 和 A2，△A=A2-A1。 | |
四、DHAR 活性计算公式：
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1.按样本蛋白浓度计算
活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟还原生成 1nmol AsA 为 1 个酶活单位。
DHAR (U/mg prot) = △A÷ε÷d×V 反总×109÷(Cpr×V 样)÷T = 92×△A ÷Cpr
2.按样本鲜重计算
活性单位定义：25℃中每克样本每分钟还原生成 1nmol AsA 为 1 个酶活单位。
DHAR (U/g) = △A÷ε÷d×V 反总×109÷(W×V 样÷V 样总)÷T = 92×△A ÷W
3.按细菌或细胞数量计算
活性单位定义：25℃中每 104 个细胞每分钟还原生成 1nmol AsA 为 1 个酶活单位。
DHAR (U/104 cell) = △A÷ε÷d×V 反总×109÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T = 92×△A ÷细胞数量
4.按液体体积计算
活性单位定义：25℃中每毫升样本每分钟还原生成 1nmol AsA 为 1 个酶活单位。
DHAR (U/mL) = △A÷ε÷d×V 反总×109÷V 样÷T = 92×△A
注：ε：AsA 在 265nm 处摩尔吸光系数为 5.42×104 L/mol /cm；106：摩尔分子换算成微摩尔分子；d：比色杯光径，1cm；V 反总：反应体系总体积，0.2mL=2×10-4 L；V 样：反应体系中加入 上清液体积，20μL=0.02mL；V 样总：提取液体积，1 mL；Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL；W ：样品质量；T：反应时间，2 min。
b. 用 96 孔板测定的计算公式如下
1.按样本蛋白浓度计算
活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟还原生成 1nmol AsA 为 1 个酶活单位。
DHAR (U/mg prot) = △A÷ε÷d×V 反总×109÷(Cpr×V 样)÷T = 184×△A ÷Cpr
2.按样本质量计算
活性单位定义：25℃中每克样本每分钟还原生成 1nmol AsA 为 1 个酶活单位。
DHAR (U/g) = △A÷ε÷d×V 反总×109÷(W×V 样÷V 样总)÷T = 184×△A÷W
3.按细菌或细胞数量计算
活性单位定义：25℃中每 104 个细胞每分钟还原生成 1nmol AsA 为 1 个酶活单位。
DHAR (U/104 cell) = △A÷ε÷d×V 反总×109÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T = 184×△A÷细胞数量
4.按液体体积计算
活性单位定义：25℃中每毫升样本每分钟还原生成 1nmol AsA 为 1 个酶活单位。
DHAR (U/mL) = △A÷ε÷d×V 反总×109÷V 样÷T = 184×△A
注： ε ：AsA 在 265nm 处摩尔吸光系数为 5.42×104 L/mol /cm；106：摩尔分子换算成微摩尔分子；d：96 孔板光径，0.5 cm；V 反总：反应体系总体积，0.2mL=2×10-4 L；V 样：反应体系中加入上清液体积，20μL = 0.02mL；V 样总：提取液体积，1 mL；Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL；W：样品质量；T：反应时间，2 min。
注意事项
1.临用前配制的试剂未使用完的 4℃保存，3 天内使用完。
2.蛋白定量测定，建议使用TargetMol生产的BCA Protein Quantification Kit (C0050)。
引用文献
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