Dehydroascorbate Reductase Activity Assay Kit (Microanalysis)

DHAR 催化 GSH 还原 DHA 生成 AsA，通过测定 DHA 减少速率，计算 DHAR 活性。

100T/96S规格的产品组成如下：

注：正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

一、自备用品：
紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板（UV板）、低温离心机、研钵、水浴锅、可调式移液枪、冰和蒸馏水。
二、粗酶液提取：

1. 组织样本：

按照组织质量（g）：CB0065M-A体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入1mL CB0065M-A）进行冰浴匀浆；8000g，4℃离心 10min，取上清置冰上待测。
2. 细菌、细胞样本：

细菌、细胞：按照细胞数量（10⁴ 个）：CB0065M-A体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议500 万细胞加入 1mL CB0065M-A），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；8000g 4℃离心 20min，取上清液置冰上混匀待测。
3. 液体样本：直接测定。

三、测定步骤：

1. 紫外分光光度计/酶标仪预热 30 min，调节波长到 265nm，蒸馏水调零。
2. CB0065M-B在 25℃水浴锅中预热 30 min。
3. 在微量石英比色皿/96 孔板中依次加入：

四、DHAR 活性计算公式：
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1. 按样本蛋白浓度计算

活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟还原生成 1nmol AsA 为 1 个酶活单位。
DHAR (U/mg prot) = △A÷ε÷d×V 反总×10⁹÷(Cpr×V 样)÷T = 92×△A ÷Cpr
2. 按样本鲜重计算

活性单位定义：25℃中每克样本每分钟还原生成 1nmol AsA 为 1 个酶活单位。
DHAR (U/g) = △A÷ε÷d×V 反总×10⁹÷(W×V 样÷V 样总)÷T = 92×△A ÷W
3. 按细菌或细胞数量计算

活性单位定义：25℃中每 10⁴ 个细胞每分钟还原生成 1nmol AsA 为 1 个酶活单位。
DHAR (U/10⁴ cell) = △A÷ε÷d×V 反总×10⁹÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T = 92×△A ÷细胞数量
4. 按液体体积计算

活性单位定义：25℃中每毫升样本每分钟还原生成 1nmol AsA 为 1 个酶活单位。
DHAR (U/mL) = △A÷ε÷d×V 反总×10⁹÷V 样÷T = 92×△A
注：ε：AsA 在 265nm 处摩尔吸光系数为 5.42×10⁴ L/mol /cm；10⁶：摩尔分子换算成微摩尔分子；d：比色杯光径，1cm；V 反总：反应体系总体积，0.2mL=2×10^-4 L；V 样：反应体系中加入 上清液体积，20μL=0.02mL；V 样总：提取液体积，1 mL；Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL；W ：样品质量；T：反应时间，2 min。
b. 用 96 孔板测定的计算公式如下

1. 按样本蛋白浓度计算

活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟还原生成 1nmol AsA 为 1 个酶活单位。
DHAR (U/mg prot) = △A÷ε÷d×V 反总×10⁹÷(Cpr×V 样)÷T = 184×△A ÷Cpr
2. 按样本质量计算

活性单位定义：25℃中每克样本每分钟还原生成 1nmol AsA 为 1 个酶活单位。
DHAR (U/g) = △A÷ε÷d×V 反总×10⁹÷(W×V 样÷V 样总)÷T = 184×△A÷W
3. 按细菌或细胞数量计算

活性单位定义：25℃中每 10⁴ 个细胞每分钟还原生成 1nmol AsA 为 1 个酶活单位。
DHAR (U/10⁴ cell) = △A÷ε÷d×V 反总×10⁹÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T = 184×△A÷细胞数量
4. 按液体体积计算

活性单位定义：25℃中每毫升样本每分钟还原生成 1nmol AsA 为 1 个酶活单位。
DHAR (U/mL) = △A÷ε÷d×V 反总×10⁹÷V 样÷T = 184×△A
注： ε ：AsA 在 265nm 处摩尔吸光系数为 5.42×10⁴ L/mol /cm；10⁶：摩尔分子换算成微摩尔分子；d：96 孔板光径，0.5 cm；V 反总：反应体系总体积，0.2mL=2×10^-4 L；V 样：反应体系中加入上清液体积，20μL = 0.02mL；V 样总：提取液体积，1 mL；Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL；W：样品质量；T：反应时间，2 min。

1. 临用前配制的试剂未使用完的 4℃保存，3 天内使用完。
2. 蛋白定量测定，建议使用TargetMol生产的BCA Protein Quantification Kit (C0050)。