CPT-1 Assay Kit (Microanalysis)

基于肉碱和脂酰辅酶A在丙二酰辅酶A存在与否的条件下，通过肉碱脂酰转移酶(CPT-I)的作用，产生脂酰肉碱，并释放出巯基辅酶A(COA-SH)，与Ellman试剂DN-TB反应后，产生黄色的TNB。通过其吸收峰值得变化（412nm），来定量分析CPT-1的活性。

100T/96S规格的产品组成如下：

注：正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

一、自备用品：
可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、研钵、冰、无水乙醇和蒸馏水。
二、样本的前处理：
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

1. 称取约0.1g组织或收集500万细胞，加入1mL CB0055M-A和10μL CB0055M-C，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2. 将匀浆液于600g，4℃离心5min。
3. 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。
4. 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的CPT-1（此步可选做）。
5. 在步骤 4 的沉淀中加入200μL CB0055M-B和2μL CB0055M-C，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3秒，间隔10秒，重复30次），用于线粒体CPT-1测定。

三、测定步骤：

1. 分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至412nm，蒸馏水调零。
2. 试剂配制：

（1）在CB0055M-E中加入1mL无水乙醇，混匀，再加入22mL CB0055M-D，混匀，37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育5min；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
（2）在CB0055M-F中加入1mL蒸馏水，混匀，37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育5min；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
3. 样本测定（在微量石英比色皿或96孔板中加入）：

四、CPT-1活性计算：
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

（1）按样本蛋白浓度计算（此法需自行测定Cpr）：
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。
CPT-1 (nmol/min/mg prot) = [ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V 样×Cpr) ÷T = 880×ΔA÷Cpr
（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织每分钟催化产生1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。
\CPT-1 (nmol/min/g 鲜重) = [ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W× V 样÷V 样总)÷T = 177.8×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。
CPT-1 (nmol/min/10⁴ cell) = [ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V 样÷V 样总)÷T = 0.3556×ΔA
注：V 反总：反应体系总体积，2.4×10^-4 L；ε：TNB摩尔消光系数，1.36×10⁴ L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，0.202 mL；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。
b. 用96孔板测定的计算公式如下

（1）按样本蛋白浓度计算（此法需自行测定Cpr）：
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。
CPT-1 (nmol/min/mg prot) = [ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V 样×Cpr) ÷T = 1760×ΔA÷Cpr
（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织每分钟催化产生1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。
CPT-1 (nmol/min/g 鲜重) = [ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W ×V 样÷V 样总)÷T = 355.6×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。
CPT-1 (nmol/min/10⁴ cell) = [ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V 样÷V 样总)÷T = 0.711×ΔA
注：V 反总：反应体系总体积，2.4×10^-4 L；ε：TNB摩尔消光系数，1.36×10⁴ L / mol /cm；d：96孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，0.202 mL；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。

1. 蛋白定量测定，建议使用TargetMol生产的BCA Protein Quantification Kit (C0050)。
2. 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
3. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。