Chitinase Assay Kit (Microanalysis)

Name: Chitinase Assay Kit (Microanalysis)
Brand: TargetMol
SKU: CB0049M
Rating: 5 (4 reviews)

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产品编号 CB0049M

别名 几丁质酶活性检测试剂盒（微量法）

规格	价格	库存	数量
100 T	¥ 1,706	10-12日内发货

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实验操作小课堂

常见问题解答

检测原理

几丁质酶水解几丁质产生 N-乙酰氨基葡萄糖，N-乙酰氨基葡萄糖与碱共热产生的中间化合物可进一步与对二甲氨基苯甲醛反应产生显色物质，该显色物质在 585nm 处有特征吸收峰，吸光值增加速率反映了几丁质酶的活性。

产品组成

100T/48S规格的产品组成如下：

组成	规格	储存条件
CB0049M-ES	60mL×1 瓶	4℃保存。
CB0049M-A	8mL×1 瓶	4℃保存。
CB0049M-B	9mL×1 瓶	4℃保存；此试剂为悬浊液，使用前需摇匀。
CB0049M-C	3mL×1 瓶	4℃保存；饱和溶液，低温（2-8℃）条件取出会有晶体析出，60℃加热使其溶解即可。
CB0049M-D1	粉剂×2 瓶	4℃保存；临用前取一瓶试剂D1，加入 21mL 试剂D2中，充分溶解，现用现配。用不完的试剂 2-8℃可以保存4周（试剂D2若有结晶可 37℃促进溶解）。
CB0049M-D2	50mL×1 瓶
CB0049M-Standard	粉剂×1 支	4℃保存；临用前加入 1mL 试剂A配制成 5mg/mL 的标准溶液，即 5000μg/mL的标准溶液，4℃可以保存 4 周。

注：正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

操作说明

一、自备用品：
可见分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液枪、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、冰和蒸馏水。
二、粗酶液提取：

组织：按照组织质量（g）：CB0049M-ES体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL CB0049M-ES）进行冰浴匀浆，然后 10000g，4℃离心 20min，取上清，置冰上待测。
细菌或细胞：按照细胞数量（10⁴个）：CB0049M-ES体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500万细胞加入 1mL CB0049M-ES），冰浴超声波破碎细胞（功率 200w，超声 3 秒，间隔 10秒，重复30次）；然后 10000g，4℃，离心 20min，取上清置于冰上待测。
培养液：直接测定。

三、检测步骤：

分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长到585nm，蒸馏水调零。
标准溶液的制备：将标准品用试剂A分别稀释为 125、62.5、31.25、15.6、7.8、3.9、1.95μg/mL 的标准溶液。
操作表：

试剂名称	对照管 (μL)	测定管 (μL)	空白管 (μL)	标准管 (μL)
粗酶液	80	80
CB0049M-A	40	40
CB0049M-B	80	80
	37℃酶促反应 1 小时，沸水浴 5min。10000rpm常温离心 5min 后取上清液。		37℃酶促反应 1 小时，沸水浴 5min。10000rpm常温离心 5min 后取上清液。
上清液	100	100
CB0049M-A			100
标准液				100
CB0049M-C	20	20	20	20
	混匀，常温静置 5min。	混匀，沸水浴 5min（缠封口膜，防止爆管），流水冷却至常温。
CB0049M-D	300	300	300	300
混匀，37℃孵育 20min，吸取 200μL 于微量玻璃比色皿/96 孔板中测定 585nm 处吸光值，分别记为 A 对照、A 测定、A 空白、A 标准。计算 ΔA=A 测定- A 对照，ΔA 标准=A 标准- A 空白。

注：标准曲线和空白管只需测 1-2 次即可。
四、计算公式：

标准曲线的绘制：
根据标准管的浓度（x，μg/mL）和吸光度ΔA 标准（y，ΔA 标准），建立标准曲线。根据标准曲线，将ΔA代入方程得到x（μg/mL）。

按照样本重量计算

酶活性定义：37℃条件下，每克组织每小时分解几丁质产生 1μg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活性单位。
几丁质酶活性 (U/g) = x×V酶促÷（V 样÷V 样总×W）÷T=2.5×x÷W
2. 按照蛋白质浓度计算

酶活定义：37℃条件下，每毫克蛋白每小时分解几丁质产生 1μg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活单位。
几丁质酶活性 (U/mg prot) = x×V酶促÷（V 样×Cpr）÷T=2.5×x÷Cpr
3. 按细胞数量计算

酶活定义：37℃条件下，每 10⁴个细胞每小时分解几丁质产生 1μg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活单位。
细胞几丁质酶活性 (U/10⁴ cell) = x×V酶促÷（V 样÷V 样总×N）÷T=2.5×x÷N
4. 按液体体积计算

酶活定义：37℃条件下，每毫升培养液每小时分解几丁质产生 1μg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活单位。
几丁质酶活性 (U/mL) =x×V酶促÷V 样÷T =2.5×x
注：V 酶促：酶促反应体积，0.2mL；V 样：加入的样本体积，0.08mL；V 样总：加入CB0049M-ES体积，1mL；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；T：反应时间，1h；N：细胞数量，以10⁴为单位，万个。

注意事项

反应结束后立即进行比色。
吸光值大于1.5或者ΔA大于1时，样本用CB0049M-ES适当稀释再测定或者缩短37℃酶促反应时间，注意计算公式修改；若ΔA小于0.01时，可以延长第一步37℃反应时间或者加大样本的加入量，注意修改计算公式。
蛋白定量测定，建议使用TargetMol生产的BCA Protein Quantification Kit (C0050)。
本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。