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规格 | 价格 | 库存 | 数量 |
---|---|---|---|
100 T | ¥ 1,944 | 10-12日内发货 |
C4H催化肉桂酸和NADP生成4-香豆酸盐和NADPH,在340nm下测定NADPH生成速率,即可反映C4H活性。
100T/96S规格的产品组成如下:
组成 | 规格 | 储存条件 |
CB0039M-ES | 100mL×1瓶 | 4℃保存。 |
CB0039M-A | 25mL×1瓶 | 4℃保存。 |
CB0039M-B | 粉剂×2瓶 | -20℃保存。 |
注:正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。
一、自备用品:
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。
二、粗酶液提取:
细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):CB0039M-ES体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL CB0039M-ES),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
组织:按照组织质量(g):CB0039M-ES体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL CB0039M-ES),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
三、测定步骤:
(1)取CB0039M-B一瓶,加入10mL CB0039M-A充分溶解混匀,置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴5min,现配现用,24h用完。
(2)按下表加入下列试剂:
试剂名称 | 测定管 (μL) |
样本 | 10 |
CB0039M-B | 190 |
混匀,立即记录340nm处初始吸光值A1和 5min后的吸光值A2,计算ΔA=A2-A1。 |
四、C4H活性计算公式:
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
单位的定义:每mg组织蛋白每分钟产生1 nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。
C4H (U/mg prot) = [ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr)÷T = 643×ΔA÷Cpr
2. 按样本鲜重计算:
单位的定义:每g组织每分钟产生1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
C4H (U/g 鲜重) = [ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V 样÷V 样总)÷T = 643×ΔA÷W
3. 按细菌或细胞密度计算:
单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟产生1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
C4H (U/104 cell) = [ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(500×V 样÷V 样总)÷T = 1.286×ΔA
注:V 反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADPH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.01 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,5 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。
b. 用96孔板测定的计算公式如下
单位的定义:每mg组织蛋白每分钟产生1 nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。
C4H (U/mg prot) = [ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr)÷T = 1286×ΔA÷Cpr
2. 按样本鲜重计算:
单位的定义:每g组织每分钟产生1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
C4H (U/g 鲜重) = [ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W× V 样÷V 样总)÷T = 1286×ΔA÷W
3. 按细菌或细胞密度计算:
单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟产生1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
C4H (U/104 cell) = [ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(500×V 样÷V 样总)÷T = 2.572×ΔA
注:V 反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADPH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:96孔板光径,0.5cm;V 样:加入样本体积,0.01 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,5 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。
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