C4H Assay Kit (Microanalysis)

C4H催化肉桂酸和NADP生成4-香豆酸盐和NADPH，在340nm下测定NADPH生成速率，即可反映C4H活性。

100T/96S规格的产品组成如下：

注：正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

一、自备用品：
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。
二、粗酶液提取：
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：CB0039M-ES体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL CB0039M-ES），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
组织：按照组织质量（g）：CB0039M-ES体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL CB0039M-ES），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
三、测定步骤：

1. 分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
2. 样本测定：

（1）取CB0039M-B一瓶，加入10mL CB0039M-A充分溶解混匀，置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴5min，现配现用，24h用完。
（2）按下表加入下列试剂：

四、C4H活性计算公式：
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1. 按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟产生1 nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。
C4H (U/mg prot) = [ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V 样×Cpr)÷T = 643×ΔA÷Cpr
2. 按样本鲜重计算：

单位的定义：每g组织每分钟产生1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
C4H (U/g 鲜重) = [ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W ×V 样÷V 样总)÷T = 643×ΔA÷W
3. 按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟产生1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
C4H (U/10⁴ cell) = [ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V 样÷V 样总)÷T = 1.286×ΔA
注：V 反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。
b. 用96孔板测定的计算公式如下

1. 按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟产生1 nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。
C4H (U/mg prot) = [ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V 样×Cpr)÷T = 1286×ΔA÷Cpr
2. 按样本鲜重计算：

单位的定义：每g组织每分钟产生1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
C4H (U/g 鲜重) = [ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W× V 样÷V 样总)÷T = 1286×ΔA÷W
3. 按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟产生1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
C4H (U/10⁴ cell) = [ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V 样÷V 样总)÷T = 2.572×ΔA
注：V 反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d：96孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。

1. 蛋白定量测定，建议使用TargetMol生产的BCA Protein Quantification Kit (C0050)。
2. 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
3. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。